分子实验第一课

第一课第一部分外源基因在大肠杆菌中的表达原理第二部分微量移液器的使用第一部分外源基因在大肠杆菌中的表达一、蛋白质的作用•研究者经常需要获得大量的蛋白质以满足各类研究的需要。比如：1，用作抗原来免疫动物产生抗体：可以是蛋白质或其部分片断。2，用于生化和细胞生物学研究：这种情况下保持蛋白质原有的功能（如高比活性酶、结合蛋白或生长因子）就显得十分重要。3，用于结构研究：要求得到的蛋白质有天然的结构。因为几乎不可能知道一种尚未知道其结构的蛋白质经变性后是否被精确地重折叠，蛋白质必须以可溶性形式产生。4，用于医疗和营养等目的二、获得目标蛋白的方法：1.从天然产物中纯化2.利用基因工程方法表达基因工程的概念：是指为了获取大量的目标蛋白而进行的有目的的蛋白质合成。方法：将编码所需蛋白质的基因插入质粒或其他载体，然后再将载体导入活细胞。利用宿主细胞的蛋白质生产系统产生目的蛋白。三、各种表达系统总体上，基因工程表达系统分为两大类，即原核表达系统（主要指指大肠杆菌表达系统）和真核细胞系统。真核细胞系统包括：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞等表达系统。各种表达系统各有优缺点。举例说明如下：1.原核表达系统•大肠杆菌表达载体：包括噬菌体载体和质粒载体，通过感染或转化大肠杆菌产生目的蛋白。•原核细胞系统主要是利用大肠杆菌细胞生产目的蛋白。•优点：该系统操作简便、周期短、收益大、及表达产物稳定。•局限：表达基因的相对分子质量有限，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。2.杆状病毒表达系统•将外源基因插入昆虫杆状病毒，通过重组病毒感染昆虫细胞而产生目的蛋白。•优点：表达效率高，昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近。•缺点：操作比较繁琐。3.哺乳动物细胞表达系统•利用病毒、质粒建立重组有外源基因的表达载体，通过感染或转染进入宿主细胞表达目的蛋白。•优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的哺乳动物蛋白质分子。•缺点：表达效率通常不高。四、利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程1.构建表达载体①选择合适的表达载体在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（通常为质粒）。应根据研究的目的选择合适的表达载体，如：融合蛋白，标签（tag)，启动子和起始密码位置等。表达载体应具有的几种主要元件包括：I.选择标志的编码序列，它可提供筛选以确定载体是否进入了宿主细胞。II.转录调控序列：可调控的强启动子（如lac,tr或tac启动子），经诱导后可产生大量的目的基因mRNA；转录终止子。III.翻译调控序列：一个位置合适的核糖体结合位点（和起始密码子ATG之间有合适的距离）。IV.一个由多个限制性内切酶位点构成的克隆位点，便于将外源基因以正确的方向插入载体中。②制备感受态大肠杆菌③将质粒DNA转化感受态大肠杆菌④提取质粒DNA⑤质粒DNA定量利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程⑥扩增目的基因•PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。•RT-PCR方法：从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。⑦纯化PCR产物⑧PCR产物定量利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程⑨将表达质粒DNA用限制性内切酶（与目的基因PCR引物相同的酶切位点）进行酶切⑩回收质粒DNA酶切产物（载体大片段）11质粒DNA酶切产物定量12PCR产物酶切13回收PCR产物的酶切片段14PCR产物的酶切片段定量15利用连接酶连接质粒DNA酶切产物及外源基因酶切片段利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程2.表达载体的鉴定①将连接产物转化大肠杆菌②抽提重组质粒③通过酶切初步鉴定重组质粒④测序验证重组质粒（检查目的基因插入方向、序列及阅读框架的正确性）利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程3.重组蛋白的诱导表达①制备宿主菌的感受态细胞②重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞③培养带有重组表达载体的大肠杆菌④诱导重组蛋白质表达利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程4.重组蛋白的纯化5.鉴定目的基因表达产物①抗体鉴定②生物活性鉴定③序列测定第二部分微量移液器的使用一、检查移液器工作状态1.测漏①吸取满量程的纯净水，将吸液头朝下悬垂20秒，观察是否有液体下滴。如果有，说明移液器出现了漏气的情况。②查找故障原因a)首先，检查吸液头安装是否到位。b)检查白套筒的端口部份（即白套筒与吸液头接触的部份）是否有刮痕。c)再检查白套筒与手柄之间的连接螺帽是否松动。按动排放按钮，感觉是否顺畅，听是否有噪音。d)观察排放杆是否有弯曲。e)旋转调节按钮，观察计数器的读数。如果上述情况正常，说明密封圈或活塞组件有损坏，需要修理。2.检查吸量准确性①吸取一定量的纯净水到微量离心管中，通过分析天平称量确定移液器的准确性。②如移液器吸量不准确，应及时请技术人员校正。二、移液过程一个完整的移液过程包括：①容量设定②安装移液头③预洗移液头④吸液⑤排液⑥卸去移液头•每一个步骤都要遵循操作规范。1.容量设定•从大值调整到小值时，刚好即可。•从小值调整到大值时，需要调超过三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。•不要将按钮旋出量程，这将导致移液器损坏。2.吸液头安装•正确的安装方法是：把白套筒顶端插入吸液头，在轻轻用力下压的同时，把移液器按逆时针方向旋转180度。•切记用力不能过猛，更不能采取剁吸液头的方法来进行安装，那样做会对移液器造成不必要的损伤。3.预洗吸液头•安装了新的吸液头或增大了容量值以后，应把需要转移的液体吸取、排放两到三次。这样做是为了让吸液头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使移液过程具有重现性。•其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在白套筒室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让白套筒室内的气体达到饱和，负压就会自动消失。4.吸液•先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸液头垂直浸入液面。尽量避免吸液头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。同时可以避免在吸取粘稠液体时在吸液头表面粘上液体影响吸取精度。•松开移液器排放按钮要平稳，切记不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。5.排液•排液时，吸液头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸液头内无残留液体。6.卸掉吸液头•一般用力下按吸液头推出器即可卸掉吸液头。•如吸液头安装过紧，则可用手卸除。•将吸液头丢弃到合适的废物收集器中。反向移液法•在转移高粘度液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量液体时，很容易导致体积误差较大。为了提高移液准确性，建议采取反向移液法。①按下按钮至第二停点，将吸液嘴没入液面下，轻缓松开按钮回原点。②将吸液头在容器壁上停靠一下，以去除多余液体。③将吸液头紧贴容器壁，轻按按钮至第一停点，排出液体。④继续按住按钮，将留在吸液嘴中未被转移的多余液体返回原来容器或随吸液头丢弃。常见的错误操作①采取剁吸液头的方法来进行安装吸液头。②直接按到第二停点吸液。③吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确。④吸液或排液时速度太快。⑤排液时未按到第二停点，吸液头中有残液。⑥平放带有残余液体吸液头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。⑦用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。⑧使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器。⑨不经常检查移液器工作状态。•参考书：《精编分子生物学实验指南》[美]F.奥斯伯等编，颜子颖等译•请预习下周实验《碱裂解法小量制备质粒DNA》•实验报告：请抄写本讲第二部分微量移液器的使用