资料一：核酸分离纯化

核酸分离与纯化中晶生物核酸在体内的分部情况：DNA真核生物：细胞核：95％细胞器：5％RNA细胞质：75％细胞核：10％细胞器：15％rRNA：80-85％，tRNA和mRNA：10-15%概述：核酸包括DNA和RNA,与蛋白质结合的状态存在结构形式多样：真核生物：染色体DNA：双链线性分子原核生物基因组DNA、质粒、真核细胞器：双链环状病毒DNA：双链/单链环状、双链/单链线状RNA：多为单链线性分子核酸分离纯化的原则：•保持其一级结构的完整性完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求遗传信息保存在一级结构中一级结构决定其高级结构一级结构决定与其它生物大分子结合的方式•排除其它分子的污染纯化核酸样品应达到的三点要求：无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在二者对酶的活性有抑制作用其它生物大分子的浓度应该尽量低蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实验去除其它核酸的污染尽量减少DNA中RNA污染，反之亦然排除异种生物的DNA/RNA污染实验中应注意的几点问题：•减少化学因素对核酸的降解避免过酸或过碱，操作时PH值多在4-10之间•减少物理因素对核酸分子结构的破坏主要是机械剪切力和高温•防止核酸的生物降解尤其是RNA抽提过程中防止RNase对RNA的降解•尽量减少操作步骤，缩短提取过程减少各种负面因素对核酸的降解细胞裂解有机溶剂的萃取、去除蛋白质及多糖定量分析核酸粗制品凝胶电泳柱吸附法电透析法去除凝胶等杂质纯的核酸制品核酸分离与纯化DNA分离基因组DNA分离质粒DNA分离凝胶DNA回收PCR产物纯化核酸抽提与分离RNA分离总RNA分离mRNA分离一、基因组DNA抽提过柱离心系列G-spinGenomicDNAKit动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌EzWayGenomicDNAKit,Multi动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌、病毒、酵母非过柱系列G-DEXGenomicDNAExtractionKit动物细胞/组织，血液GenomicDNAPurificationKit:动物细胞/组织，血液、植物、细菌G-spinGenomicDNAKit分离示意图分离原理高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离简要流程•结合•洗涤•洗脱样本数量（细胞）DNA产量(ug)DNA纯度SNU1(Human)3million25-352.04SNU601(Human)3million25-352.0B16(Mouse)3million30-402.02HeLaCells3million27-362.0NB43million23-332.01操作时间：15-20分钟样本数量（mg）DNA产量(ug)DNA纯度Spleen(Mouse)20mg22-302.01Kidney(Mouse)30mg30-402.0Liver(Mouse)30mg30-402.0细胞组织EzWayGenomicDNAKit,Multi原理：同G-spinGenomicDNAkit特点：试剂无毒性缺点：价格相对IntRON贵推荐：细胞/组织、血液、植物/食品、细菌－G-spin系列酵母－EzWay系列病毒DNA/RNAmix－G-spin系列基因组DNA抽提常见问题分析(一)Q1、洗涤后硅胶膜上有杂色残留细胞裂解不充分,裂解液和样品要充分混匀Q2、洗脱产物DNA量很少或没有A、样品中细胞或病毒浓度低B、裂解液和样品混合不均匀造成的细胞裂解不充分C、蛋白酶K活性下降造成的细胞裂解不充分D、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。E、DNA洗脱效率低，离心柱中加入洗脱液后室温静置至少1min，再离心F、洗脱液pH不对，低pH值减少DNA产率。确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。G、洗脱体积大，超过200μlDNA浓度会降低，但DNA总量不会减少Q3、A260/A280比值较低用水作为洗脱液时，比值偏低Q4、A260/A280比值较高大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降Q5、DNA影响后续酶反应实验A、在洗脱液中有残留的漂洗液，可通过再次离心去除B、大量RNA残留基因组DNA抽提常见问题分析(二)质粒特性介绍：o大肠杆菌染色体DNA较质粒DNA大得多o染色体DNA为线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子宿主菌（一般是大肠杆菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：二、质粒DNA抽提小量抽提GeneJETPlasmidMiniprepKit（有现货）同下面产品类似，价格相对要贵DNA-spinPlasmidDNAExtractionKit（价格更有优势）所有后续分子生物学操作，包括转染EzWayPlasmidDNAKit,Mini（价格太贵）测序、体外转录与翻译、酶切、转化、文库筛选中量抽提DNA-midiPlasmidDNAExtractionKit测序、转染、体外转录与翻译分离示意图分离原理高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离简要流程•结合•洗涤•洗脱质粒DNA抽提常见问题分析(一)Q1、未提出质粒或质粒得率较低A、大肠杆菌老化：涂布平板，重新挑新菌落B、质粒拷贝数低：更换具相同功能的高拷贝载体C、菌体中无质粒：有些质粒（Cosmid）本身不稳定，多次转接后可能丢失检查抗生素使用浓度是否正确。D、碱裂解不充分：菌液过多，菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液用量。低拷贝数质粒，加倍使用溶液，有助于增加提取量和质粒质量。E、吸附柱过载：不同吸附柱吸附能力不同，如果提取质粒量很大，多次提取。F、质粒溶解不充分：洗脱溶解质粒时，加温或延长溶解时间G、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率H、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有影响。洗脱体积增大，回收率增高I、洗脱时间太短：洗脱时间对回收率有影响。洗脱时放置一分钟可达到较好效果质粒DNA抽提常见问题分析(二)Q2、质粒纯度不高A、混有蛋白：减少菌量。如果混有蛋白悬浮物，再次离心去除B、混有RNA：RNaseA处理不彻底，减少菌量C、混有基因组DNA：加入溶液后要温和混匀剧烈振荡会剪碎基因组DNA，混杂在质粒中细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16小时。D、菌株含大量核酸酶：降解质粒DNA，影响质粒DNA完整性选用不含核酸酶的宿主菌，如DH5α和Top10E、裂解时间过长：请参考说明书推荐流程F、质粒二/多聚体形式：复制时形成，与宿主菌相关，电泳可检出三、凝胶DNA回收过柱方法：MEGA-spinAgaroseGelExtractionKit(价格优势，优先推荐)凝胶DNA回收，100bp-10kb，20分钟，70-90％MEGAquick-SpinPCR&AgarsoseGelDNAExtractionKit凝胶、PCR或酶切产物回收，87bp-20kb，20分钟，效率95％MEGA-beadAgaroseGelDNAExtractionKit凝胶DNA回收，87bp-20kb，20分钟，效率95％EzWayGelExtractionKit（价格过高）凝胶回收，100bp-10kb，20分钟，效率70-80％非过柱方法：DNAExtractionKit凝胶回收，非过柱，120bp，20分钟，效率80％分离示意图分离原理高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离简要流程•结合•洗涤•洗脱凝胶DNA回收常见问题分析Q1、未回收或回收得率较低A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下高盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带95度加热后退火使单链DNA重新退火复性四、PCR产物纯化过柱方法：PCRquick-spinPCRPurificationKit(优先推荐)除去核苷酸、酶、引物、矿物油、盐离子、EB、染料、去污剂、dNTP/、过柱、15分钟，效率90%MEGAquick-SpinPCR&AgarsoseGelDNAExtractionKit除去核苷酸、引物等，过柱，20分钟，效率95％EzWayPCRClean-UpKit(价格过高)过柱，100bp-10kb，20分钟，效率90-95％非过柱方法：DNAExtractionKit去盐、有机溶剂、核苷酸、引物等，120bp，20分钟，效率80％分离示意图分离原理高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离简要流程•结合•洗涤•洗脱PCR产物纯化常见问题分析Q1、未回收或回收得率较低A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下高盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带95度加热后退火使单链DNA重新退火复性TotalRNA：MessengerRNA(mRNA)RibosomalRNA(rRNA)TransferRNA(tRNA)五、RNA抽提非过柱方法——最经典的RNA抽提方法TRIReagent（TRIzol）（重点推荐，有现货）过柱方法：easy-SpinTotalRNAExtractionKit硅胶吸附原理，30分钟，纯度高，无DNA残留，动植物细胞/组织RNA-spinTotalRNAExtractionKit硅胶吸附原理，细胞、组织、细菌，30分钟，效率95％ViralGene-spinViralDNA/RNAExtractionKit硅胶吸附原理，，同时分离病毒的DNA/RNA。20分钟MRC公司简介：美国公司，全名MolecularResearchCenter(MRC)，专门致力于开发各类DNA、RNA抽提试剂。TRIreagent：专利产品，唯一商业化的从样本中同时抽提RNA、DNA和蛋白质的生物试剂。TRIzol是MRC公司的注册商标。相关产品：TRIreagent：组织（动物、植物）、单层培养细胞TRIreagentBD：全血、血清TRIreagentLS：细胞悬浮液、其它液体标本TRIreagentRNA抽提操作流程：•组织匀浆（50mgtissue/mlTRI）•室温静置5‘-10’（细胞裂解过程）•加氯仿（0.2ml/mlTRI），剧烈震荡15‘’•室温静置2‘-3’（氯仿使蛋白变性）•4度12000g,15’•取上清，加异丙醇(0.5ml/mlTRI)，混匀室温静置15‘•4度12000g,10’•去上清，75％乙醇洗沉淀•风干,15‘•溶解，保存RNA质量检测标准：测A260/A280，要求1.80变性电泳检测（参考条带）28SrRNA（~5kb）18SrRNA（~2kb）5StRNA（0.1~0.3kb）补充说明：原核生物rRNA大小应为23S和16S。一般情况下，28S(23S)与18S(16S)带的亮度高过柱法分离RNA示意图分离原理高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离简要流