实验二：细菌涂片的制备和染色镜检1

实验二细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色细菌染色的目的意义：细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。染色剂分类：碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构。酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于染细胞质。复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次体。涂片染色程序：涂片自然干燥固定染色干燥镜检细菌涂片示例：水实验内容：1、细菌抹片的制备：玻片准备：透明、洁净、无油渍。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。2、细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、细菌常用染色方法：革兰氏染色法细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色细菌抹片的制备革兰氏染色法：1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。2.初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。4.脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。革兰染色步骤涂片草酸铵结晶紫碘液95%酒精稀释的石炭酸复红自然干燥媒染2-3min脱色20~30s固定初染1-2min复染10~30s干燥镜检接种环蒸馏水滴水革兰染色时注意事项：1、要用幼龄培养物作革兰染色；2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭酸复红复染后细胞呈红色。革兰氏染色法原理：革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。革兰氏染色法过程示意图革兰氏染色法动画涂片干燥固定染色1~2min水洗、吸干镜检细菌的单染色显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色法——细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。细菌形态与结构检查法普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。普通光学显微镜(lightmicroscope)显微镜放大法电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。电子显微镜(electronmicroscope)肺炎链球菌荚膜荚膜显微镜放大法透射电镜扫描电镜细菌的大小与形态观察细菌常用光学显微镜，其大小用测微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm)为单位。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而有差异。细菌按其外形，主要有球菌杆菌螺形菌球菌(coccus)脑膜炎奈瑟菌双球菌(diplococcus)肺炎链球菌链球菌(streptococcus)球菌(coccus)球菌(coccus)葡萄球菌(streptococcus)球菌(coccus)四联球菌(tetrad)球菌(coccus)八叠球菌(sarcina)杆菌(bacillus)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌3-10μm大中大肠埃希菌2-3μm小布鲁菌0.6-1.5μm杆菌的形态多样杆菌(bacillus)两端齐平炭疽芽胞杆菌两端尖细白喉棒状杆菌杆菌(bacillus)杆菌的形态多样分枝杆菌双歧杆菌螺形菌(spiralbacterium)弧菌螺菌螺杆菌细菌抗酸性染色特殊染色法是对细菌特殊结构进行染色的方法。包括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养体的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养体细胞困难。方法：采用碱性染料微加热着染或延长染色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体方法，并可在显微镜下区别。孔雀石绿—沙黄法染色步骤涂片沙黄复染水洗脱色孔雀石绿自然干燥脱色20~30s固定初染7min复染10~30s干燥镜检接种环蒸馏水孔雀石绿蒸汽芽胞染色结果是：营养体染成红色，芽孢染成绿色。