实验五 微生物培养基配制与灭菌

1.提供营养和条件2.防止污染一.培养基：微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等一.培养基：微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐2.特殊营养：维生素、生长因子等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧气的需求：细菌：6.5-7.5；放线菌：7.5-8.5；真菌：5.0-6.0。4.种类：固体培养基液体培养基有无凝固剂琼脂分离鉴定工业生产化学成分：物理性质：天然培养基合成培养基微生物培养基的配制与灭菌目的要求1.明确培养基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步骤。2.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。（预习）培养基配制原则⑴目的明确：⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当⑶适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸（CO2碳源）生产科研培养基的配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，溶解。调pH值：用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。过滤分装包扎，挂上标签（灭菌指示条），注明何种培养基和配制时间。灭菌：1210C20min倒置平板检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。按培养基配方称量加水加热熔化调节pH值过滤分装包装灭菌检查灭菌彻底与否培养基的配制和灭菌过程中的注意事项1.蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。3.在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。4.pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。5.分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免引起污染。2.称药品时严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。培养基配制–器材培养基、玻璃器皿天平秤、药匙培养基的配制–装水1.以量桶装取适当量蒸馏水于玻璃容器中2.于玻璃容器上标示培养基名称培养基配制–秤药1.放上秤药纸并归零2.以秤药匙舀出适当量培养基(请看培养基罐上说明)培养基配制–溶解培养基倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上注意事项–配药结束1.清理配药桌面与天平2.清洗秤药匙，擦干放回3.药品放回药品柜培养基配制–分装1.调整分注器(Dispensette)刻度2.分装试管3.盖上试管盖6.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。不能灭菌的物质：1.爆炸性物质硝化丙烷、硝化甘油、硝化纤维，含氮硅酯。三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮复合物。过醋酸、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰和其它过氧化有机物。2.lgnitable物质金属锂、钾、钠、黄磷、氧化硫，和红磷。培养基的配制和灭菌过程中的注意事项实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于分离和培养细菌的基础培养基，又称天然培养基。配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g自来水1000mLpH7.2~7.4淀粉琼脂培养基（高氏一号），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：可溶性淀粉20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4•7H2O0.01g琼脂20g自来水1000mLpH7.4－7.6查氏培养基，用于分离和培养霉菌，是一种合成培养基。配方如下：NaNO32.0gK2HPO41.0gKCl0.5gMgSO40.5gFeSO40.01g蔗糖30g琼脂20g自来水1000mLpH自然LB(Luria-Bertani)培养基1000mlLB培养基的配方H2O定容至1000mL胰蛋白胨(Tryptone)10g氯化钠（NaCl）10g琼脂（agar）15g酵母提取物(Yeastextract)5g20gYPD培养基foryeast1000mlYPD培养基的配方H2O定容至1000mL蛋白胨(peptone)20g琼脂（agar）20g酵母提取物(Yeastextract)10g葡萄糖1-2%耐高温需保持干燥的物品，160～170℃1-2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121℃、15～30min二.无菌技术：防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：湿热灭菌的优点湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固湿热的穿透力比干热大，水的传热能力比许多非导体的固体强湿热的蒸汽有潜热存在，1g水在100℃由气态变为液体态可放出2.26kJ，可增强灭菌效果培养基和玻璃器材的灭菌方法放入杀菌锅(Autoclave)灭菌培养基配制–灭菌加水盖过铁板放东西关门调整温度时间关紧泄压阀注意事项–杀菌锅的使用注意事项–杀菌釜使用灭菌结束后，等压力降回零时才可打开门进入杀菌釜之物品，盖子不可关太紧或太松注意事项–杀菌釜使用拿灭菌后物品请记得带耐热手套培养基配制–平板培养基灭过菌之固态培养基于无菌操作台(Laminarflow)内倒制平板培养基(Plate)日光灯UV灯风扇培养基和玻璃器材的灭菌方法培养基和玻璃器材的灭菌方法间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。培养基和玻璃器材的灭菌方法过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。培养基和玻璃器材的灭菌方法紫外线灭菌法：一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。培养基和玻璃器材的灭菌方法化学药剂消毒灭菌：微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。培养基和玻璃器材的灭菌方法本次实验报告内容记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。思考题固体培养基加琼脂的作用是什么？干热灭菌和高压蒸汽灭菌和有何不同？培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?实验五第二节微生物检验的基本操作技术主要内容无菌技术M的接种与分离技术微生物的培养方法微生物的生长现象与观察（一）什么是无菌技术指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境无菌室无菌柜超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）、用紫外线灭菌处理30~60分钟；（3）、检查无菌器材是否完备；（4）、洗手消毒；（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准。（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红来菌，后端铁棒部分过火无菌操作–取菌技巧12.试管前端过火3.打开试管盖无菌操作–取菌技巧14.试管倾斜，放入接种环无菌操作–取菌技巧15.试管前端过火，盖上试管盖6.接种环烧红灭菌无菌操作–取菌技巧15.试管前端过火，盖上试管盖6.接种环烧红灭菌无菌操作–取菌技巧12.自Plate上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入)(方法二：plate反面拿起)无菌操作–取菌技巧21.挤出安全吸球内空气，插上灭过菌之玻璃吸管2.向上为吸，向下为放无菌操作–取菌技巧31.调整Pipetman刻度(P1000吸取范围200~1000μl)2.插上灭过菌之Tip(用力插紧)无菌操作–取菌技巧43.按钮压至第一段(不可压至最底)4.深入液面下2~4mm无菌操作–取菌技巧45.慢慢释放按钮，即可吸取液体无菌操作–取菌技巧41.试管前端过火2.打开试管盖无菌操作–接菌技巧方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以Pipetman吸取菌液，按钮压至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液无菌操作–接菌技巧操作时离火源遥远试管直放，空气中菌体容易掉入无菌操作–错误示范无菌操作–错误示范安全吸球倒放，菌液容易流入吸球内安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上无菌操作–错误示范Pipetman倒放，菌液容易流入Pipetman内注意事项–生物性废弃物生物性废弃物放至正确位置以便灭菌二、微生物的接种与分离技术（一）、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种２）三点接种３）穿刺接种４）浇混接种(二)、分离纯化１、倾注平板法２、涂布平板法倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水３、平板划线法平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法稀释混合平板法：1、先加菌2、倒平板时注意培养基温度3、混合均匀