第四章PCR技术

书上第5章PCR相关技术的发展一、RNA的聚合酶链反应RT-PCR(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析，还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR先在反转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大，易于检测。RT-PCR是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，运用此法可检测单个细胞中少于l0个拷贝的特异RNA。RT-PCR可应用于：（1）对基因转录产物进行定性与定量的检测。（2）对基因转录中剪切与拼接的检测。（3）克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交（RNAdot）等而言，RT—PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。如植物方面，RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。对基因转录中剪切与拼接的检测：如果RT—PCR引物确定了mRNA片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点，用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。反转录步骤cDNA链合成,互补mRNA链，一般利用polyT作为引物，也可用特异性的序列作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物PCR步骤电泳分离不同大小的DNA片断RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物，而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无RNase的DNase处理反转录产物，消除DNA后，再进行PCR。蛋白质末除净可与RNA结合，从而影响反转录和PCR反应。常用反转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病毒（avianmyeloblastosisvirus，AMV）和莫洛尼鼠类白血病毒（Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV）的反转录酶。AMV反转录酶由两个不同的亚基组成，具有较强的RNaseH活性，可水解RNA模板，以RNA为模板合成单链DNA的酶活性最适作用温度为42℃。MoMLV反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为37℃，RNaseH活性较低，适于合成大片段全长cDNA。但当模板RNA的二级结构影响反转录反应时，用AMV反转录酶更合适，因为较高的反应温度可消除RNA二级结构的影响。此外，这两种反转录酶的缓冲液有所不同。近来从嗜热栖热菌HB8中分离得到的Tth耐热DNA聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，95℃时该酶的半衰期为20分钟，具有5’-3’外切酶活性，无3’-5’外切酶活性，利用Tth耐热DNA聚合酶同时具有反转录酶的特点，可简化RT-PCR，且比用TaqDNA聚合酶的反应敏感性高100倍，因此Tth聚合酶比TaqDNA聚合酶更优越。TthDNA聚合酶作用温度高，可消除RNA的二级结构对反转录反应的影响，增加TthDNA聚合酶的反转录活性，可增加RT-PCR反应敏感性。TthDNA聚合酶的缺点是其反转录酶活性需Mn2+，而Mn2+会降低DNA聚合酶的忠实性，TthDNA聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为1/500。二、cDNA末端快速扩增（rapidamplificationofcDNAends，RACE）尽管cDNA克隆技术发展迅速，但获得mRNA的全长转录物cDNA往往是比较困难的。尤其是获得mRNA的5’端。这是因为mRNA反转录本身的限制。mRNA的二级结构、转录条件和转录引物均影响这一过程。目前，通过预处理减少mRNA二级结构，改善反转录条件和使用特异引物延伸的cDNA等一系列措施便全长cDNA的克隆成功率增加。这种过程需要几周乃至数月才能完成。PCR技术为cDNA克隆方法开辟了新纪元。使用cDNA末端的快速扩增可在1一2天内完成反转录cDNA的分析。我们知道，在有些mRNA分子中，从poly（A）尾到5'帽子之间有一段很长的距离，因而仅利用poly（A）尾来获得全长cDNA可能比较困难，甚至无法实现。因为长的mRNA的反转录过程往往会提前终止，PCR扩增也存在同样的问题。RACE技术正是为了解决这种困难而设计的一种用于获取mRNA末端信息（尤其是5’端序列）的有效方法。应用RACE技术能扩增从mRNA内部已知序列处至3’poly（A）尾或至5’人工加上的锚定序列之间的区段。由于在仅已知单侧序列可供设计特异性引物时应用RACE技术仍能完成扩增，因而RACE又称为单侧PCR（single-sidePCR）；而且RACE技术应用了供引物附着的锚序列，因此RACE又属于锚定PCR。所谓RACE是指以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3'端或到5'端之间的未知核苷酸序列。因而又可分为3'RACE和5'RACE两种，此处的3'和5'是针对mRNA而言的，如5'RACE是指特定位点到相应于RNA5'端的序列。特定位点是指cDNA基因内位点，依据此位点所设计的PCR引物称为基因特异性引物(gene-specificprimer，GSP)。RACE所使用的起始总RNA或mRNA仅需约lμg甚至少到lng，可扩增出丰度低于0.00001%的RNA，甚至仅有几个RNA分子亦可被检测出来，因此RACE技术可直接用于扩增和克隆低丰度mRNA的末端。以oligo(dT)n和被称为锚定引物(anchoredprimer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT反转录mRNA模板得到第一条cDNA链.加入RNaseH降解RNA模板。然后用含有部分锚定引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSPl进行第一轮扩增，得到双链cDNA第二轮及以后的扩增刚采用内部引物(nestedprimer)Ql和基因特异性引物GSP2进行，以防止产生非特异性扩增产物。用基因特异性引物GSP-RT反转录mRNA获得cDNA第一条链然后用末端转移酶在cDNA5'端加上Poly(A)尾巴紧接着先以QT引物和GSP-RT引物进行PCR扩增获得cDNA第二条链再以Q0和GSP-RT上游引物GSPl扩增cDNA;最后采用内部引物Ql和GSP-RT下游引物GSP2进行随后的多轮PCR扩增以提高产物特异性。扩增后得到的双链cDNA用限制性核酸内切酶酶切和杂交分析并进行克隆，得到5‘特异性和3’特异性的cDNA文库。从两个有互相重叠顺序的5‘和3’RACE产物中可以获得全长cDNA，或者可以先分析5‘和3’端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA。显然，RACE不仅可以避免常规PCR扩增效率低和特异性差的问题，而且可以简便快速地获得cDNA文库中不易得到的全长cDNA克隆。（三）新型RACERNA连接酶介导的RACERNA连接酶介导的RACE与传统RACE的最主要区别在于：在反转录这一步骤之前，锚定引物直接加在mRNA的5‘端.RACE的应用1、在克隆cDNA方面的应用1)获取低丰度mRNA的cDNA克隆方面与建立cDNA文库相比具有明显优势。2)从cDNA文库得到的cDNA克隆经常会出现5’末端残缺的现象，相比之下，用RACE技术则能获得cDNA完整的5’末端信息。3)用常规的RT-PCR扩增cDNA，必须已知mRNA双侧的序列，而RACE技术在仅已知单侧序列时仍能完成扩增反应，因而适用范围更加广泛。2、在基因表达检测方面的应用应用RACE技术可以快速、简便地检测基因的表达情况。在增加使用与靶mRNA同源的异种mRNA作为竞争性的内标准之后，RACE作为一种特定的RT-PCR也可用于测定低丰度靶mRNA的含量，尤其适用于检测稀少样品中的mRNA，甚至可用于研究单个细胞在特定发育时期及环境下基因的不同表达状况，而如此高的灵敏度是传统的Northern杂交分析和RNase保护鉴定所无法达到的。三、反向PCR对于已知序列的DNA片段只要设计合适的引物，常规PCR就可扩增位于两个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA。然而在分子生物学研究中，经常需要鉴定紧邻已知顺序的DNA片段，如编码DNA的上游及下游区城、转位因子插入位点等。在PCR技术出现以前，要测定已知基因两侧未知的序列是非常繁杂的。一般都需先用限制性内切酶进行消化，再用已知顺序的侧翼区段作为探针进行Southern杂交，来鉴定合适大小的末端片段，然后从制备性凝胶上纯化这些片段，克隆到载体上，得到的重组子进一步与已知顺序的侧翼区探针杂交以鉴定合适的克隆。为测定未知的侧翼区顺序还常需亚克隆出各种片段。该方法的基础是将侧翼区DNA转变成为引物内围区域。其做法是首先用合适的限制性内切酶在已知DNA序列之外切割，再将形成的限制性DNA片段自身连接成环状分子。环化DNA线性化时，限制性内切酶唯一切点必须位于核心DNA上所用的引物仍然和已知序列两端顺序同源，不同的是它们的3‘端方向转向侧翼区的未知DNA序列。经过一般的PCR扩增之后，其产物就是该环状分子中未知序列的DNA片段。也可将环化DNA线性化后再进行PCR，有报道认为，用线性化DNA进行IPCR扩增效率可提高100倍。限制性内切酶的选择对IPCR很重要，将已知的DNA序列称做核心DNA，第一步消化基因组DNA模板时，必须选择核心DNA上无酶切位点的限制性内切酶，若产生黏性末端DNA片段则更易于环化。此外，限制性内切酶消化后产生的DNA片段大小要适当，太短（200~300bp）则不能环化，太长的DNA片段则受PCR本身扩增片段有效长度的限制。环化DNA线性化时，限制性内切酶唯一切点必须位于核心DNA上，未知序列无此酶的识别位点。当酶切后两个末端不互补而无法直接连接时，可用Klenow或T4DNA聚合酶先将其补成平末端后再环化。通常在连接前，需要用酚抽提或加热使限制性内切酶变性失活。应用上述方法，对研究转位因子、反转录病毒以及所有可以整合或转位到基因组中的其他DNA序列，都可收到良好的效果。其主要优点是简单、快速，可以研究许多独立的克隆。但反向PCR也有其局限性。第一，由于旁侧序列是未知的，故在选择合适的限制性内切酶时，常需要用几种酶做预试验或选择几种可以产生片段大小合适的酶；第二，许多常用的限制性内切酶不但在插入序列上有切点，同时在载体上不合适的位置也有切点。四、实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCRFluorescencequantitativePCR）(RealtimeQuantitativePCR)实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法滤镜轮CCD相机光源灯滤光镜96孔板多元镜双色镜夫累Ｘ尔透镜96孔透镜组反射镜光学原理图常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件扩增曲线实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光