基因敲除方法专题-郭

生命科学研究进展基因功能研究之基因敲除技术生物科学技术学院郭志富2014年11月21日什么是基因？为什么要研究基因？如何研究？原核体外表达真核过表达定量表达位置—分类--结构—功能蛋白质功能体外鉴定转基因表达规律-qPCR前言基因敲除进一步验证体内蛋白水平验证Westernblotting如何获取基因同源克隆：已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等优点：简单，短平快局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低后续试验内容需增加蛋白差异分析：性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列端部分析---DNA信息差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并性过高高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂图位克隆群体至关重要---工作量超大---获得基因随机---仍是王道寻找性状差异性状分离不分离软件分析初步定位回交-扩大群体图位克隆策略杂交-F1选择父母本差异显著（最好其他性状差异较小）自交或突变体单粒传构建群体表型统计分子标记SSR等近等基因系精细定位1-5cM甚至更小基因组文库探针筛选目标基因连锁的分子标记叠连克隆群染色体步移外显子的分离、鉴定功能互补实验确定基因转基因过表达、基因敲除基因敲除专题基因敲除概述基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造染色体上某一基因的目的。同源重组敲除技术条件性基因敲除法诱导性基因敲除法锌指核酸酶(ZFNs)技术RNA干扰技术TALEN技术CRISPR-Cas9技术基因敲除的方法生物学家的梦想：随心所欲地操作基因划时代的基因靶向操作技术：TALE与CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦我们不再大海捞针！！！经典基因操作：1.Genetrap:化学诱变；转座子--------海量的筛选+goodLuck2.同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-2难！3.突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性。4.充满梦想却幻灭的ZFN：•难以完全找到匹配的3连子锌指；•Off-target严重。美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”5.完美基因靶向操作：识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNA干扰技术RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。一、RNAi的发现简史90年代初，RichJorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制现象(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。What’smore...•1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA(antisenseRNA)去阻断秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis.elegans)的par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA(senseRNA)作为对照,也同样阻断了基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。反义RNA技术•反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。•由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli的产肠杆菌素的ColE1质粒中发现的，许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。反义RNA技术•根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：•Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列(Shine-Dalgarnosequence）和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解•Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；•Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。•这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达。•后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。•并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。反义RNA技术的原理•利用基因重组构建人工表达载体,使其体外或体内表达反义RNA,通过碱基互补与靶RNA配对结合,封闭或抑制靶基因的表达,从而对细胞的功能产生影响二、RNAi现象的普遍性随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。三、RNAi的作用机制基因沉默基因沉默分为转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)两种：TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致;PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。rRNAi过程的功能单元：siRNA•siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶称为Dicer。19ntduplex2nt3’overhangs第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。DicerRISC碱基互补酶解第二步第一步RNAi的放大效应机制•siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次级siRNA。形成一种链式反应，使特定的基因表达被阻止。四、RNAi研究的一般技术路线目的基因mRNA序列分析设计siRNA序列正义RNA和反义RNA的合成构建转基因载体转入受体细胞检测基因抑制结果存在的问题目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为RNAi应用的最大障碍；如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；目前RNAi机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA的稳定性在多基因家族中的非特异性问题如何将RNAi技术运用到临床试验TALE(TranscriptionActivator-LikeEffector)是由植物致病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该种蛋白通过其内部保守的重复氨基酸序列（即DNA结合域）与植物宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异性结合，并激活基因表达。TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。TALEN技术TALEN技术形成的关键研究SugisakiHiroyukiJensBoch发现FokI核酸酶破译TALE序列（1981）（2009）DanielF.VoytasAdamJ.Bogdanove将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN。(2011)TALE的发现迅速成为科技最前沿•2011年《Nature》杂志将TALEN技术列为年度技术，2012年的《Science》杂志则将其列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。TALEdomain:DNA识别域TALE，植物病原体黄单胞菌Xantomonas–用于调控宿主基因由34个氨基酸长度的重复单位构成第12，13位点氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同RVD决定识别位点不同Nucleasedomain:DNA剪切域FokI，发现于海床黄杆菌Flavobacteriumokeanokoites采取其非特异性DNA剪切结构域形成二聚体时发生剪切N’C’TALEFokILTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVL