第九章植物离体繁殖2010

第八章植物离体快繁一、植物快繁的器官形成方式二、植物快繁的程序三、影响快繁的因素四、植物快繁的商业化应用植物离体繁殖(Propagationinvitro)又称植物快繁或微繁殖(micropropagation),是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养,使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。植物快繁研究意义（1）繁殖速度快，经济效益高。（2）占用空间小，管理方面，不受季节限制，便于工厂化、自动化育苗。（3）保持植物种性。（4）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。非洲菊不定芽在增殖培养基上快速增殖繁殖速度：一个花蕾一年可以产生4.21×1011个芽海芋北京锦绣大地农业股份有限公司一、植物快繁的器官形成方式（一）短枝发生型（二）丛生芽发生型（三）不定芽发生型（四）胚状体发生型（五）原球茎发生型短枝发生型丛生芽发生型非洲菊不定芽在增殖培养基上快速增殖繁殖速度：一个花蕾一年可以产生4.21×1011个芽胚状体发生型原球茎发生型二、植物快繁的程序（一）离体无性繁殖程序：（1）无菌培养物制备（2）培养物的增殖（3）生根培养（4）炼苗和移栽（5）再生植株的鉴定芦荟组织培养过程12345（1）无菌培养物的建立无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择－外植体灭菌－接种－培养等基本过程。（2）培养物的增殖腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖;愈伤组织增殖原球茎增殖腋芽增殖不定芽增殖特点：繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株。遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。非洲菊不定芽在增殖培养基上快速增殖繁殖速度：一个花蕾一年可以产生4.21×1011个芽胚状体增殖特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术。愈伤组织增殖所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程(愈伤组织诱导－愈伤组织增殖－芽分化－生根－完整植株)，它属于真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁。原球茎增殖细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。生根是获得完整植株的一个关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种。一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定）。（3）生根培养0.05mg.L-1、0.03mg.L-1和0mg.L-1NAA（从左到右）对非洲菊生根的影响另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100mg/L左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。一些难生根的植物用生长素加黑暗处理效果好。糖含量最好下降一半。另外也可以将无根小苗直接嫁接到根系良好的砧木上。（4）炼苗和移栽试管苗的生长环境无菌异养适温弱光恒温试管苗的特点①根的生理功能低②叶片表面极易散失水分③叶光合能力较低。提高其移栽成活率的措施：A、移栽要抓三个关键①水分的平衡（不要失水过多）②温度和光照（不能太高）③光合能力逐步形成或加强B、提高移栽成活率的技术措施①移栽前的工作②移栽时应注意的问题移栽前的工作a、培养壮苗加入生长控制剂，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。b、炼苗将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为10~30d。移栽时应注意的问题：a、防止菌类滋生①苗底部培养基要洗干净。②杀菌剂处理苗的根部。③定时用杀菌剂处理栽培基质。常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托布津，使用浓度0.1％。b、保持小苗水分供给平衡在移栽后5~7d内，应给予较高的空气湿度条件（90%），使叶面的水分蒸发减少，让小苗始终保持挺拔的状态。当5~7d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。c、移栽时选择合理的种植基质基质要疏松透气，保水保肥性好，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用泥炭、蛭石，珍珠岩，细沙，椰糠，锯木屑等。珍珠岩椰糠蛭石锯木屑泥炭d、注意一定光照，温度条件试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18~20℃，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照，促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。红薯电热温床育苗圃三、影响快繁的因素外植体：来源、生理年龄、大小培养基：基本培养基、生长调节物质、物理性质培养条件：光照、温度、湿度、气体继代培养：继代频率移栽：移栽成活率全世界组培苗产量从1985年的1.3亿株增加到目前的10亿株以上，形成了美国的Wyford国际公司、以色列的Benzur苗圃、印度AVT实验室等一批植物快繁商业公司或实验室，实现了植物生产的工厂化。四、植物快繁的商业化应用（一）商业化生产规模及工艺流程1.试管苗生产规模的确定：应以市场为导向，按实验设备来确定，尽量减少经济损失。2.商业化实验室的设计3.商业化生产的配套设施4.商业化生产的工艺流程不同的商业化实验室的布局差异较大，较为理想的平面布置如下：培养室（保存材料）培养室1(生产车间）培养室2(生产车间）培养室3(生产车间)办公室贮藏室走廊低温培养室观察室接种室1准备室1接种室2准备室2灭菌室配置和称量室洗涤室优良稀缺药用植物资源茎尖、茎段或其它材料消毒无菌试管苗脱毒试管苗试管苗扩大繁殖光培炼苗沙培炼苗温室营养袋苗沙培苗大田苗圃商品苗接种车间培养车间移栽车间病毒鉴定商品试管苗（温室或大棚）商业化生产的工艺流程（二）商业化生产及效益分析1.试管苗增殖率的估算：试管苗的增殖率多数以芽或苗为单位，但原球茎或胚状体因难以统计，多以瓶为单位。。增殖率的计算有理论计算和实际计算两种方法。增殖率的理论值是指接种一个芽或一块增殖培养物，经过一段时间培养后得到的芽或苗数。增殖率的实际值是指接种一个芽或一个苗，经过实际繁殖周期，得到的实际芽或苗数。一株葡萄试管苗，理论上一年可繁殖1x312，即53万株，但实际繁殖株数为3.1万株。出现差异的原因：（1）污染淘汰（2）出售、转让和实验所用（3）移栽死亡（4）培养容器等设备的限制2.生产计划的制定和实施生产计划的制定：生产计划的制定是进行试管苗规范化生产的关键，生产量不足或过剩，都会造成直接的经济损失。依据：市场对试管苗的种类、品种及数量的需要及趋势，实验室设备的生活条件和规模。一般生产数量应比计划销售的数量增加20%~30%。试管苗的出瓶日期应比销售日期提前40~60d。生产计划的实施布骤：准备繁殖材料、合格繁殖材料的快速繁殖月计划生产苗数=每个操作人员每天可接苗数*月工作日*人员数3.产品质量监控接种状况、污染率、生长情况、生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试管苗出瓶标准。4.商品化生产效益分析成本核算非常重要。了解生产过程中的各种消耗管理工作的质量各项技术措施的效果产品价格的制定标准成本主要包括：人工费用生产物质费用水电费用其他费用办公费、培训费、差旅费、种苗费、宣传费等。（三）降低商业化生产成本的措施提高劳动生产率减少设备投资，延长使用寿命降低消耗降低污染，提高繁殖率和成活率简化培养基考试题目：×××组织培养的研究进展就目前国内外某种植物组织培养的研究、发展现状及其今后发展趋势写一篇综述性论文（包括题目、摘要、关键词、正文和主要参考文献五部分）要求内容丰富、思路清晰，语言流畅、字数不少于4000字，A4纸打印，在第17周的星期二（12.20）下午（4:00~5:00）交到新二教805S。电话：[phone]封面：题目：姓名：学号：专业：班级：论文题目摘要关键词正文参考文献（四）商业化生产应注意的问题污染及控制1、污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。2、污染原因（从病原菌分析）（1）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后1~2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3~10天才能发现。主要是霉菌污染。3、污染途径：（1）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁4、污染的预防措施：A、防止外植体带菌（1）选择好外植体采集时期和采集部位●外植体采集以春秋为宜；●优先选择地上部分作为外植体；●阴雨天勿采，晴天下午采集；●采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。（2）室内或无菌条件下进行预培养。（3）外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌B、保证培养基及接种器具彻底灭菌1．分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口2．检查封口膜是否破损3．扎瓶口要位置适当，松紧适宜4．保证灭菌时间和高压锅内温度5．接种工具用前彻底灭菌6．工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌C、操作人员严格遵守无菌操作规程D、保证接种与培养环境清洁（1）污染瓶经高压灭菌后再清洗（2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒（3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前15~20min打开风机，风速调整到20~30m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒（4）定期对培养室消毒，防止高温遗传稳定性影响遗传稳定性的因素基因型继代次数器官发生方式降低遗传变异的措施：选择不易发生遗传变异的基因型缩短继代时间，限制继代次数采用不易发生变异的增殖方式选用适当的生长调节物质并降低使用浓度玻璃化实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。原因培养基中的琼脂和蔗糖浓度培养温度生长调节物质浓度乙烯浓度光照培养基含氮量具体解决的方法为：①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；②减少培养基中含氮化合物的用量；③增加光照；④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；两个“增强”：增强容器通风；增强光照；两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA；一个“减少”：减少培养基氮含量褐变外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现