GUS活性的定量检测

GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。试剂：①磷酸缓冲液母液：0.2MNa2HPO4：71.64g/LNa2HPO4·12H2O0.2MNaH2PO4：31.21g/LNaH2PO4·2H2O②GUS抽提液（1L）：PH=7.00.2MNa2HPO4152.5mL0.2MNaH2PO497.5mL14.3Mβ-ME700uLNa2-EDTA·2H2O3.72gTriton-X1001mL③10mM4-MUG（10×）：105.6mg4-MUG溶于30mLGUS抽提液中，4℃避光保存。（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。④0.2MNa2CO3反应终止液（1L）：21.2gNa2CO3溶于1000mLddH2O。⑤BSA母液（4ug/ul）：40mgBSA溶于10mLddH2O⑥4-MU母液（10mM）：17.6mg4-MU溶于10mL0.2MNa2CO3中，4℃避光保存。⑦ProteinAssayBuffer（5×，Bio-Radcat.no.500-0006）：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液仪器及用品：酶标仪TECANInfiniteM200酶标板（Nunclon96FlatTransparent和Greiner96FlatBlack）操作步骤与注意事项：1.材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近，方便后续操作。）2.10000g4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4度短期保存或于-70℃长期保存；但不要存于-20℃，该温度下GUS不稳定）。3.总蛋白浓度测定（Bradford法）：3.1先取BSA标准品（4ug/ul），用ddH2O稀释8个梯度，浓度分别为2000ng/ul、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625ng/ul。方法：取8个管子，各加50uLddH2O，取50uL4ug/ul的BSA母液加入第一个管子，吸打混匀之后从中再取出50uL加入第二个管子，依此类推。（注意，稀释时至少取50uL进行操作，取少了不准确，浓度偏差会比较大，影响标准曲线的制作。稀释后可在4℃短期保存。）3.2将各个样品的总蛋白抽提液、空白对照（GUS抽提液）以及8个BSA标准品各取2uL加入到透明酶标板（Nunclon96FlatTransparent）中，加入198uL1×ProteinAssayBuffer，在5-20min时间内测定595nm的吸光值。（注意，放置超过20min会产生沉淀。）3.3TECANInfiniteM200程序设置：（开机、关机顺序请见酶标仪上面的说明书）①打开Magellan软件，点击将弹出放酶标板的座子，将酶标板放上去之后再点一下则把酶标板送入酶标仪。（注意：不是用手推的！放酶标板的时候要记住自己加样的位置，有没有盖盖子）②选择creat/editamethod，点击，选择new则可新建一个方法。首先选择酶标板型号Nunclon96FlatTransparent，如果盖了盖子就在platewithcover前打勾；其次选择样品所在的位置，黄色表示该孔加了样品，仪器只检测黄色区域。③继续选择测量方法，从左侧选项中找到Absorbance，鼠标左键选中，拖拽到中间松开左键则建立吸光度测定方法，再在出现的选项框中选择合适的参数：测定595nm，还可根据需要选择内参（reference），每个孔测定次数与位置（multiplereadsperwell和Numberofflashes）等。④再点击，在出现的界面中填写空白对照（）、标准品（）和样品（）的位置。（填清楚了一是防止遗忘，二还可以通过软件自动计算出样品浓度；也可以全部选，后期自己用excel计算，依各人习惯。）⑤继续点击，保存方法，若选择则在保存后马上开始测量。⑥测量结束后，选择edit-copytoexcel则可将结果导出到excel中。点击，保存结果，最后点击，取出酶标板。3.4以标准品的浓度为横坐标，相应的OD595为纵坐标作散点图，添加线性趋势线，显示公式和R2值，将各样品的OD595值代入公式中的y，算出x则为各样品的总蛋白浓度。4.GUS活性的测定：4.1取10-100ug总蛋白（具体用量要先做个预实验确定，注意叶绿素含量过高会影响检测），加入1mL含有1mM4-MUG的GUS抽提液中（反应液应提前预热），于37℃反应，在第5min，15min，25min以及35min时各取出200ul加入800ul0.2MNa2CO3（Na2CO3有终止反应以及增强荧光信号的作用）。（注：GUS活性在较长一段时间内会保持线性，所以第一个时间点并不一定要在把样品加入到底物中的那一刻取，可以过几分钟再取，如第5min；一般高表达的每隔5-10min取一次样，低表达的30-60min取一次样，取3-4个时间点。）4.2准备4-MU标准品，按照稀释BSA的操作用0.2MNa2CO3将10mM4-MU稀释12个梯度，分别为1mM、0.5、0.25、……去掉高浓度的5个，用低浓度的7个做标准曲线。稀释好的4-MU可在4℃短期保存，注意避光。4.3将反应产物吸出200ul加入到黑色酶标板中（Greiner96FlatBlack），每板都要加4-MU标准品，即7个浓度梯度稀释液各取出40ul，加入160ul0.2MNa2CO3，上酶标仪检测。4.4TECANInfiniteM200程序设置方法同3.3，不同的是将Absorbance改成FluorescenceIntensity：Excitation为365nm，Emission为455nm；Mode选择Top；滞后时间lagtime为0；测量时间Integrationtime不管设成0.1秒还是10秒，最后出来的数据都被自动转换为1秒的值；Gain类似于量程，对结果产生的数据影响很大，关系到能否拉开差异，一般用Optimal自动优化。4.5得到数据之后同3.4作标准曲线，计算各个样品反应产生4-MU的浓度。5.计算GUS活性：pmol4-MU/ug总蛋白/min