甘氨酸含量测定法

附录XX甘氨酸含量测定法试剂和溶液试剂：三水合醋酸钠（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、异硫氰酸苯酯（PITC，生化试剂，含量不低于98%）、三乙胺（色谱级）、正己烷（色谱级）、乙腈（色谱级）。溶液：三乙胺溶液：取0.7ml三乙胺加入1ml乙腈。PITC溶液：取16µlPITC加入1240µl乙腈（PITC含量约1.25%）。0.25MNaAC(pH6.5)溶液：称取34.02g三水合醋酸钠，用800ml水溶解，用冰醋酸调pH值至6.5，定容至1000ml，用0.45µm滤膜过滤。50mMNaAC(pH6.5)-5%ACN溶液：取100ml0.25MNaAC(pH6.5)溶液，加入25ml乙腈，定容至500ml，混匀即得。80%ACN溶液：取100ml水加入400ml乙腈，混匀即得。色谱条件与溶液制备色谱柱采用ZORBAXEclipseXDB-C18柱，尺寸为4.6×150mm，粒径为5µm；以流动相A为50mMNaAC(pH6.5)-5%ACN溶液，流动相B为80%ACN溶液，流速1.0ml/min，柱温为35℃进行梯度洗脱，洗脱梯度参见表1；于254nm波长处检测。表1：洗脱梯度表时间（min）A%B%0100021000158515251090301090321000401000对照品溶液的制备：精密称定甘氨酸国家标准品，配制成约1.0mg/ml（即0.1%）的水溶液，取200µl，加入100µl三乙胺溶液、100µlPITC溶液混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷充分混匀，静置10分钟，取下层溶液再次加入0.4ml正己烷充分混匀，静置10分钟，取下层溶液用水稀释10倍；待测品溶液的制备：取3支rhIL-11成品，用灌装体积的水复溶，混匀，稀释一定倍数使甘氨酸含量约为1.0mg/ml（即0.1%），用3K超滤器超滤，取超滤后下层溶液200µl按甘氨酸对照品溶液处理；系统适用性试验溶液的制备：另配制1.0mg/ml精氨酸溶液，取出100µl，与1.0mg/ml甘氨酸溶液100µl混合，按甘氨酸对照品溶液处理。测定法对照品溶液和待测品溶液分别制备2份，每份溶液进样20μl，重复进样2次；系统适用性试验溶液制备1份，进样1次。用外标法计算待测品中甘氨酸含量。计算公式：C=（A1/A0）×C0×K×100%其中：C：待测品的甘氨酸含量（%）；A1：待测品溶液进样4针主峰平均峰面积；A0：对照品溶液进样4针主峰平均峰面积；C0：甘氨酸对照品的浓度（%）；K：待测溶液的稀释倍数；系统适用性要求甘氨酸和精氨酸的分离度应不小于2，待测品和对照品重复进样峰面积的RSD应不大于3%。判定标准以外标法计算待测品甘氨酸含量，应为1.8%~2.8%。