微生物实验室基本能力和要求

食品微生物实验室的基本能力和要求微生物基础知识微生物的概念微生物一词并非生物分类学上的专门名词，而是对所有形体微小、单细胞的或个体结构较为简单的多细胞的、甚或没有细胞结构的低等生物的通称。微生物类群十分庞杂，其中包括：不具细胞结构的病毒；属于原核生物的立克次氏体和细菌等；属于真核生物的霉菌、酵母菌、藻类和原生动物等；以及属于古菌的产甲烷菌等。微生物是一个通称：形体微小，结构简单的低等生物。病毒、细菌、放线菌、真菌…种类多、分布广繁殖快适应性强易变异认识微生物微生物的特点：●分布广、种类多(目前已知的约10万种)●生长旺、繁殖快(大肠杆菌在适宜温度下每20-30分钟繁殖一代)●适应性强●易变异(如对药物的耐受)球菌(coccus)脑膜炎奈瑟菌双球菌(diplococcus)肺炎链球菌链球菌(streptococcus)球菌(coccus)球菌(coccus)葡萄球菌(streptococcus)球菌(coccus)四联球菌(tetrad)球菌(coccus)八叠球菌(sarcina)杆菌(bacillus)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌3-10μm大中大肠埃希菌2-3μm小布鲁菌0.6-1.5μm杆菌的形态多样杆菌(bacillus)两端齐平炭疽芽胞杆菌两端尖细白喉棒状杆菌杆菌(bacillus)杆菌的形态多样分枝杆菌双歧杆菌螺形菌(spiralbacterium)弧菌螺菌螺杆菌微生物在自然界中的分布►土壤►空气►水►人、动植物体微生物与食品的关系1作为食品的微生物(食用菌)2生产食品的微生物(发酵食品)3引起食品腐败的微生物4引发食物中毒的微生物食品中微生物的污染►食品微生物污染，是指微生物及其产生的毒素通过直接或间接的各种途径进入到食品中，使食品受到污染。食品中微生物污染的危害美国，每年约有7200万人发生食源性疾病，造成3500亿美元的损失2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发，发病人数上千人80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人•沙门氏菌（禽、畜肉）•副溶血性弧菌（水产品）•蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）•肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）•单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）•大肠杆菌O157:H7（肉制品）等。微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化13.820.417.424.602003年9.765.503.61总阳性率0.520.820.61O157:H75.761.290.96单核细胞增生李斯特氏菌3.593.42.23沙门氏菌2002年2001年2000年全国食品中三种致病菌连续监测阳性率变化02468101214162000200120022003沙门氏菌单核细胞增生O157:H7总阳性率食品中微生物的污染源土壤中微生物对食品的污染：与土壤接触过的动、植物性产品等水中微生物对食品的污染：加工、清洗用水的卫生质量与食品污染有直接关系空气中的微生物对食品的污染：生产环境的空气质量、尘埃密度与食品污染有关人及动物体的微生物对食品的污染：微生物污染食品的途径►通过动物体自身携带的病原菌污染：内源性污染►通过水污染►通过空气污染►通过生产加工过程污染►通过运输过程污染►通过贮存过程污染►通过昆虫和媒介动物污染WHO保障安全食物的五个关键其内容包括:保持清洁：生食与熟食分开；彻底烹调食物;在安全温度下保存食物；使用安全的水和安全的原料。食品卫生微生物检验的范围►生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。►原辅料检验：包括动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。►食品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。►食品的检验：重要的是对出厂食品、可疑食品及食物中毒食品的检验。食品微生物检验的指标►食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。食品微生物指标的意义►菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。霉菌和酵母评价食品卫生质量的指示菌造成腐败变质pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品食品微生物指标的意义►大肠菌群：包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及动物肠道内的常居菌，它随着粪便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。故以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量，具有广泛的意义。北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。项目依据耐热大肠菌群NMKL、ISO粪大肠菌群NMKLAOAC定义在44.5℃培养，24h内能产酸产气的细菌在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。食品微生物指标的意义►致病菌：致病菌即能够引起人们发病的细菌。不同的食品根据其受致病菌污染的风险程度，选择一定的菌群进行检验。例如：海产品以致病性弧菌作为检测目标；蛋与蛋制品以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为被检菌；米、面类食品以蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群；肉类食品检测单增李氏菌、致病性大肠杆菌等；罐头食品以耐热性芽孢菌作为参考菌群等等。肠道杆菌(entericbacilli)一大群居住在人和动物肠道中生物学性状近似的革兰阴性杆菌属于肠杆菌科多数是肠道的正常菌群，至少有30个菌属，120个以上的菌种少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌在环境和食品卫生学上，常被用作粪便污染的检测指标卫生学意义大肠杆菌(大肠埃希氏菌属Escherichiacoli)是人类和动物肠道中的正常菌群是国际公认的卫生监测指示菌出生后数小时就进入肠道，并终生伴随有些菌型是人或动物的病原菌菌株作用部位所致疾病致病机理ETEC小肠旅行者腹泻婴幼儿腹泻ST、LTEPEC小肠婴儿腹泻粘附和破坏上皮细胞EIEC大肠痢疾样腹泻侵袭和破坏结肠粘膜上皮细胞EHEC大肠出血性结肠炎Vero毒素致病性大肠杆菌引起的腹泻性疾病其中许多为人畜共患病一大群人与动物肠道中的寄生菌菌群菌型甚多，仅少数对人致病沙门氏菌广泛存在于动物肠道、内脏中引起中毒的主要是动物源性食品金黄色葡萄球菌急性化脓性感染食物中毒正常人带菌，30-80%通过工人手和呼吸道污染食品单增李斯特氏菌人、畜共患，4℃生长，冷藏食品预防措施：充分烹调产品，对于经过热处理的食品应防止交叉污染。耐盐，在10%的盐中也可生长革兰氏阳性短小杆菌形态与染色涂片中呈穿梭样运动非常活泼液体中排列整齐呈鱼群状革兰染色阴性弧型或逗点状，单鞭毛霍乱弧菌（V.cholerae）生物学特性嗜盐（halophilic）在培养基中以含3.5%NaCl生长最为适宜在“我妻氏琼脂平板”上产生溶血现象神奈川现象（Kanagawaphenomenon）副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）其它食品微生物指标►霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起中毒，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等等。其它食品微生物指标►微生物指标还包括病毒，如肝炎病毒、诺沃克病毒，以及人畜共患病病原如：禽流感病毒、口蹄疫病毒、疯牛病病原等。另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫、囊尾蚴、住肉孢子虫、蛔虫、肺吸虫、弓形体、螨、姜片吸虫、中华分枝睾吸虫等等。食品企业常检的微生物项目►微生物计数项目：菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、霉菌、酵母菌计数。►致病菌：沙门氏菌、致病性大肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核增生李氏菌、金黄色葡萄球菌►其它：商业无菌、抗生素残留食品微生物检验的一般程序►食品微生物检验是一门应用微生物学理论与实验方法的一门科学，是对食品中微生物的存在与否及种类和数量的验证。在生物科学中，微生物学是一门实践性最强的学科之一，它有一套自己独特的研究方法。要做好微生物检验，必须具有坚实的微生物学基础知识，熟悉各种致病菌的生物学特性；掌握各种致病菌、霉菌和病毒的检验程序。微生物检测的一般流程致病菌检测：增菌（直接增菌或选择性增菌）-筛选-纯化-生化反应和血清学反应微生物检测室的通用技术要求►微生物检测室必须通过外部和内部控制活动来保证相对稳定的质量。►微生物检验作为一个检测领域，其检验室除了具有实验室的一般要求外，因其自身的特点兼具有特殊的技术要求。一、对人员的要求有颜色视觉障碍的人员不能执行某些实验实验室人员应熟悉生物测试安全操作知识和消毒知识实验人员应具备高中毕业以上文化程度，要不断培训提高检测技术和操作能力微生物学实验的主要内容：无菌操作技能的培养无菌概念的建立无菌操作：环境：无菌区人员：无菌概念物品：严格灭菌无菌操作的概念人员要求►实验室人员的分类：管理人员、技术人员、技术支持人员等。►相应岗位的人员，应具备相应的技术能力，相应的技术能力证明（证书及证件）。►微生物检验室因有相应技术能力的人负责室内的技术工作。并设立质量监督员。人员的卫生要求(ISO7218)►在个人卫生方面，为避免污染样品和培养基，避免个人感染的危险，需要注意下列事项：►穿浅色的、干净的、卫生状况好的实验工作服，这些工作服由布制作，可减少燃烧的危险，这类工作服不能穿出工作区，和衣帽室；►如果必要戴上帽子和口罩以保护头发和胡须；►修好指甲并保持指甲干净，指甲不能留太长；►进行微生物检测前后和去厕所后用自来水彻底洗手，自来水由非手动开关控制；洗手时用液体或粉状肥皂，也可用消毒剂，用适宜的分配容器以一种正确的清洁方式取用。用一次性纸巾或一次性毛巾擦干手；►接种时不能说话、咳嗽等；►在实验区不能吃喝和抽烟；►有感染（甲沟炎）或生病的人员应特别注意，有病部位可能导致细菌污染样品使结果无效；►不要把个人消费的食品放在实验室冰箱里。二、对设施和环境条件的要求实验室的总体布局和各部位的安排应减少潜在的对样本的污染和对人员的危害。►设施要求以能获得可靠的生物测试结果为重要依据►无菌工作区域应予以明确标识，并能有效地控制、监测和记录布局示例缓冲走廊办公室仪器室清洗消毒室培养基室微生物检验室实验台缓冲室无菌室缓冲室ISO7218对实验环境的要求►微生物实验的环境不能影响分析的可靠性。►对场地要求的关注是为了避免交叉污染，应用“单向流动