郜刚分子生物学-05-DNA半不连续复制

2.4.3DNA的复制(下)8复习：DNA复制的大致过程：1：双链解开8、DNA复制的过程：2：引发体形成DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引发酶完成这个任务引物长度约为几个至10个核苷酸引发酶是一个特殊的RNA聚合酶，这个现象叫转录激活8、DNA复制的过程：3、延伸•复制的终止比较简单，当复制叉遇到DNA序列上重复出现的终止序列时，8、DNA复制的过程：4、终止切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链复制的终止的实现•a、终止序列E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白序列一：terEterDterA序列二：terFterBterC每个区域只对一个方向的复制叉起作用•b、专一性终止蛋白E.coli中由tusgene编码通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用一个问题？•在复制叉上DNA聚合酶分子要负责两条模板链的复制，虽然新生链的生长方向只能是5’-----3’，但是两条模板链的方向又是相反的，所以新生链的合成方向也是相反的。如果酶分子沿着一条模板链向前进，那么另一条模板链上的复制就无法进行，但是体内观察发现两条链上的复制几乎是同时进行的，这个问题是怎么解决的？推测：•两个酶分子？•NO！•复制叉上根本容纳不了两个酶分子•两个活性中心？•YES冈崎的发现•OKAZAKI•3H标记复制中的DNA•DNA复制过程中总是存在一条长的新生链•还存在一些短的小片段DNA单链，而且这些小片段DNA单链在DNA连接酶的作用下能够转化为成熟的DNA链•小片段长度约在1000-2000bp推断•1、DNA复制过程中两条链不是同时合成的，存在一定的时间差•2、一条链先合成是连续的，称为前导链；另一条链是不连续的，称为后随链•3、一个酶分子同时完成前导链和后随链的复制，说明这个酶分子有两个活性中心，一个活性中心复制前导链的合成，另一个活性中心负责后随链的合成DNA聚合酶的结构特点：双组分不对称核心酶合成先导链合成后随链两个核心酶各负责合成一条链αεθαεθδγψχδ3维持二聚体β夹子β夹子安装复合体聚合活性3’-5’外切活性激活θ夹住DNA前进ββββDNA聚合酶的组装过程αεθαεθββδγψχδ3双组分的不对称结构1夹子安装机把beida夹子结合在DNA上，随后解离2由αεθ组成的核心酶安装上来3核心酶通过τ亚基连接起来ββ链延伸过程中的酶DnaBαεθαεθδγψχδ3维持二聚体聚合活性DnaG引发酶引发一段引物5’后随链先导链DNA聚合酶的双组分不对称结构保证了先导链的连续复制和后随链的不连续复制，结果两条链可以在各自的模板上同时前进DnaBαεθαεθ5’DnaGDnaBαεθ5’当先导链复制出大约一个冈崎片段长度，在后随链上暴露出第一个引物结合位点，引发酶引发一段引物，夹子安装机就将β夹子结合上来，继而核心酶结合，形成全酶，后随链的α亚基利用这段引物合成第一个冈崎片段。由于先导链上的合成一直在持续，复制叉前端还在解链，于是新解开的后随链模板就形成了一个loop结构随着loop的形成，后随链上的核心酶解离，释放出已经合成的冈崎片段，并且在复制叉前端暴露出了下一个冈崎片段的引物，于是β夹子结合上来，继而核心酶结合，形成全酶，完成下一个冈崎片段的复制。。。。。。如此重复直至终止。DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和后随链同时合成当先导链复制出大约一个冈崎片段长度，在后随链上暴露出第一个引物结合位点，引发酶引发一段引物，夹子安装机就将β夹子结合上来，继而核心酶结合，形成全酶，并且后随链在酶分子上拆绕了180°，后随链的α亚基利用这段引物合成第一个冈崎片段。由于先导链上的合成一直在持续，复制叉前端还在解链，于是新解开的后随链模板就形成了一个loop结构随着loop的形成，后随链上的核心酶解离，释放出已经合成的冈崎片段，并且在复制叉前端暴露出了下一个冈崎片段的引物，于是β夹子结合上来，继而核心酶结合，形成全酶，完成下一个冈崎片段的复制如此重复直至终止。滞后链的延长:DNApolⅢ全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。由于模板形成环,酶向前移动时,滞后链合成片段也沿5′→3′方向生长,与酶催化方向一致。滞后链片段合成接近前方滞后链片段5′末端时,模板被释放,环消失。继续重复,连续进行。半不连续复制模型：这个模型认为，由于两条新生链的生长方向是相反的，所以先导链和后随链不是同时进行的。先导链的复制先开始而且是连续的，当先导链复制出一定长度之后，后随链才开始复制，而且是不连续的。只有当前一个冈崎片段复制完成，暴露出下一个冈崎片段的引物引发位点之后，才进行下一个冈崎片段的复制.请看下图：半不连续复制模型先导链前进方向后随链前进方向问题：1，22.3.3几种复制方式•复制方式不同于“复制机制”•线性DNA的复制：复制叉式的复制•环状DNA的复制：θ复制滚环复制D环复制•不需要RNA引物的复制2.3.3DNA复制的几种主要方式1.线性DNA双链的复制特点在于：1、多个起点，起点都不在线性DNA的端点（末端），而是在内部2、采用复制叉式的双向复制，两个复制叉，两个方向，有先导链和后随链之分3、末端的复制采用特殊的方式（后面讲）4、真核生物采用的复制方式：2.环状DNA双链的复制•θ复制:首先由J.Carins从大肠杆菌中观察到,又称为Carins复制。（双向复制）•滚环复制（rollingcirclereplication)（单向复制）•D环复制（Dloopreplication)：线粒体DNA复制（单向复制）JohnCairns’experimentIn1963,JohnCairns:GrewE.coliin3HthymidineWaitedtillcellswereinthemiddleofreplicationLysedthecellsveryverygentlySpreadthelysateonanEMgridExposedthegridtoX-rayfilmforTWOmonthsReplicationoftheE.colichromosome经典实验分析OriginofReplicationθ复制约翰·凯恩斯Thereplicationeyebecomeslargerasthereplicationforksproceedalongthereplicon.Notethattheeyebecomeslargerthanthenonreplicatedsegment.Thetwosidesoftheeyecanbedefinedbecausetheyareboththesamelength.PhotographkindlyprovidedbyBernardHirt.OriginscanbemappedbyautoradiographyandelectrophoresiswhatCairns’experimentshowed:θE.colihasacircularchromosomeE.colihasasingleoriginofreplicationInE.coli,replicationandunwindingaresimultaneousJohnCairnsprovidedawell-designeddemonstrationofE.colichromosomalreplicationin1963.Inhisexperiment,heradioactivelylabeledthechromosomebygrowinghisculturesinamediumcontaining3H-thymidine.Thenucleosidebasewasincorporateduniformlyintothebacterialchromosome.Hethenisolatedthechromosomesbylysingthecellsgentlyandplacedthemonanelectronmicrograph(EM)gridwhichheexposedtoX-rayfilmfortwomonths.ThisExperimentclearlydemonstratesthethetareplicationmodelofcircularbacterialchromosomesWhatCairnsdidnotshow:•Isreplicationunidirectionalorbidirectional?•Istheoriginofreplicationunique?•Whereistheoriginofreplicationlocated?①Cyclechromosome②Semicoservativereplication③DirectlymeasurethechromosomallengthofE.coliConclusions:④Unwound-replicate-rewound⑤Onlyoneorigin（oriC）Twocycleslinkedasapattern.1100m11000003.4=3.2106bpθ复制的特点•多数环状DNA采用的复制方式•复制叉式复制，两个复制叉，双向等速或者不等速复制•有先导链和后随链之分滚环复制环状亲本DNA，双链ori限制性内切酶在复制起点识别特异序列，切开一条单链3’-OH5’-p5’末端常常与特殊的蛋白质结合，受到保护，而在3’末端不断地由DNA聚合酶催化，以没有切断的那条环形链为模板，合成新的互补链3’-OH5’-p3’-OH这里的新生链是共价结合在模板链的互补链上的3’端不断的滚动，而5’端则不断地被甩出去？以单链为模板，通过不连续复制（冈崎片段），复制出另外一条链，最后通过切割和连接重新环化。φX174滚环型复制：单向复制的特殊方式T.Brownetal.,如：ΦΧ174的双链环状DNA复制型（RF）（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需RNA引物，新生链在正链3‘－OH上共价延伸延伸（3）只有一个复制叉;复制是单向的D环复制单向复制的特殊方式线粒体DNA、叶绿体DNA两条链的复制高度不对称一个或者多个起点没有先导链和后随链之分特殊的DNA复制方式•用蛋白质做引物的复制•腺病毒•腺病毒的DNA复制首先是以5′端结合有pTP的dCMP作为引物，以3′端的末端反向重复序列（ITR）为模板，进行链置换（stranddisplacement）合成，置换出的单链分子可以自我退火环化，形成锅柄样环形分子，然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。dCTP另外一种复制的表述方式根据DNA合成的起始方式，复制可以分为两种类型，一类是从新起始，即先导链是从新开始的，这种类型主要是复制叉式复制，占大多数另一类是共价延伸，即先导链是共价结合在一条亲本链上，这种类型主要是滚环式复制。2.4.3复制的调控许多现象表明，DNA的复制是受到调控的。比如原核细胞在不同的生长条件下细胞的分裂速度是不同的，举个例子：大肠杆菌细胞在37℃碳源充足的时候，分裂一次需要46分钟；而在碳源不充足的时候，分裂一次需要10个小时，但是在两种情况下，DNA复制的速度都是40分钟左右DNA复制的调控•自学教材50-51页•补充一种新的调控模式：（4）细菌(E.coli)DNA每个细胞周期复制一次可能受OriC甲基化的控制甲基化-------活化半甲基化------失活而且原核细胞的DNA复制的调控和真核细胞的DNA复制的调控是不同的纠正教材上的一个说法p49表2-12•真核生物DNA聚合酶的功能：•DNA聚合酶α：负责起始两条新链的合成，引物是由引发酶合成的•DNA聚合酶β：负责修复•DNA聚合酶δ：先导链的延伸（主要的复制功能）•DNA聚合酶ε：可能负责后随链的延伸•DNA聚合酶γ：负责线粒体中DNA的复制原核生物DNA复制调控