定量PCR的应用和开发(PDF37)(2)

1定量PCR的应用和开发陈云地8008100192，[e-mail]2提要™应用开发指南™引物设计软件™实验设计思路™技术应用举例应用开发指南4应用开发基本流程使用PrimerExpress™软件设计引物和探针Use优化引物和探针的浓度Primers:900nMeach；Probe:250nMeach(generally,Primers:300nMeach;Probe:200nM)证实系统只能检测cDNA不能检测基因组DNAAssayDevelopmentComplete注意避免單管及小體積操作5应用开发指南•探针设计指南–免费赠送PrimerExpress软件–TaqMan探针Tm68ºC-70ºC–MGB探针Tm65ºC-67ºC•引物设计指南–引物Tm58ºC-60ºC–短PCR产物50-150bp•PCR程序指南–通用的PCR条件2步法：95ºC@15sec,60ºC@1min•实验条件快速优化指南–所有实验在同样条件下完成–固定的PCR试剂浓度2XTaqMan®UniversalPCRMasterMix–只需简单优化引物/探针浓度6引物设计指南1.先设计探针，再设计引物；2.引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠；3.G-C含量保持在30-80%之间；4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；5.用PrimerExpress®软件计算出来的Tm值应当在58-60°C之间；6.在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。7为什么要避免3’端的G和C？Designrule:5nucleotidesatthe3'endhaveonly1-2G+C’sprimertemplatepolymerisation3'5'Transientbindingat3'endofprobeisquicklystabilisedbytheDNApolymerase8MGB探针设计指南1.探针的5'端第一个碱基不能是G；2.用PrimerExpress®软件计算出来的MGB探针Tm值在65-67°C之间；3.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基；4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；5.C比G多的探针效果更好，如果C少于G，则使用互补链；6.检测SNP或者基因突变，多态或突变位点尽量位于探针中央，可以±3个碱基并在倒数第二个碱基之前。9探针设计指南基因表达、cDNA定量研究，特别设计探针跨过两个外显子，增强反应特异性3'RQTaqMan探针Exon1Exon3Exon210为什么探针要C比G多？反义链：11C/3G正义链：3C/11G11MGB探针设计指南SNP和基因突变位点在MGB探针中的位置NNNNNNNNNNNNNNNNNNNpolymorphismTrytopositionthepolymorphismhere(centralthird)Ifnecessary,putthepolymorphismhere(regionofMGB)DONOTPLACEHERE12PrimerExpress软件13探针的荧光标记14热循环程序指南Taq激活UNG灭活UNG激活2-步PCR15引物浓度优化指南16引物浓度优化Nn„高浓度/高效率„高浓度/低效率„低浓度/高效率N:产物数量n:循环数17探针浓度优化LowestCtandhighestdeltaRnisbetter18定量PCR基本流程1.准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)2.PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCRmix)3.填样品表(样品名、孔位，样品类型、探针颜色)4.设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)5.运行PCR，自动分析数据6.进一步分析数据(基线、阈值、CT值、相对表达等)19DNA反应体系ComponentsStockConc.AddVolumeFinalConc.DNA510-100ngUniversalMasterMix2x251xForwardPrimer45uM150-900nMReversePrimer45uM150-900nMTaqManProbe2.5uM550-250nMH2O13Total50uL50°C2min→95°C10min→(92°C15sec→60°C1min)x40循环反应体积：96孔板25-50uL；384孔板5-20uL20cDNA反应体系cDNA(1-100ngRNA反转录所得cDNA)12xUniversalPCRmastermix1020xProbe/Primermix1H2O8Total20uL50°C@2min→95°C@10min→(92°C@15sec→60°C@1min)x40循环反应总体积：96孔板25-50uL；384孔板5-20uL实验设计思路22实验设计实验设计策略反向策略设计恰当的引物，符合反应条件确定标准的反应化学确定标准的热循环程序设计合乎标准的扩增子大规模流水线生产GUARANTEEDPERFORMANCE正向策略修改反应条件适应PCR引物小规模实验23课题设计定量PCR中医中药现代化•实验方案设计–选择具有免疫调节功能的中药单方或配伍（1方）–选择免疫相关基因（5个）–选择对该中药反应敏感的实验对象（50人）服药前（对照）、服药后不同时间点（共5点）–RNA/cDNA制备：选择外周血或者特异的免疫组织（2种）–反应总数：5个基因x50人x5个时间点x2种组织x6次重复=15000•所需资源预算–7000型定量PCR仪（1台）–96孔板160块，按每天4块计算，1个半月完成(40天)–试剂：网上定购5种基因表达试剂盒(20x，250uL/kit)(10uL/rxn,500rxn/kitx6kit=3000rxn/gene)TaqManUniversalPCRMasterMix试剂盒(2000反应/kit/25uL，10uL5000反应x3kit)反转录试剂盒(共500rxn,200rxn/kitx3kit)24SNP与表现型ClassicAssociationStudiesCasesATGCAAGCTGATCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGCATGCAAGCTGTTCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGCControls25课题设计肝硬化的个体差异•假设前提：人胶原IV基因及其调控序列的多态性是肝硬化个体差异的原因之一。•实验方案：–SNP位点：在人胶原IV基因上挑选8个SNP位点调控序列，外显子，剪接点，Block–样本组：50个病人+50个正常对照–DNA提取：外周血–反应总数：800个•成本估算：–时间：大约10块96孔板，3天完成–试剂：定购8种SNP试剂盒或代客合成服务26课题设计肝硬化个体差异结果分析•正常组50人：AA38，AG10，GG2•疾病组50人：AA20，AG10，GG20•3X2卡方统计分析，计算P值–小于0.05：显著差异–小于0.01：非常显著•讨论：–该位点GG纯合子基因型可能与肝硬化的发生有关系–如果是随机选择的SNP位点，则致病基因可能位于该位点附近–如果临床诊断或分类不准确，则结论站不住脚27免费软件SNPbrowserSNP字典：全部4百万个人类SNP位点，4万个人类基因中国人、日本人、白人、黑人4个人群的单倍型信息免费下载：类应用：实时定量檢測基因轉殖食品(GMO)最佳利器溶血性貧血胎兒(RhD)的早期偵測器官移植排斥反應之早期預知肥胖基因與糖尿病之關聯性各種癌症基因表現量研究心臟血管疾病基因監測SNP資訊與疾病關聯性胎兒早產預知檢查細胞自體凋零研究優生保健篩檢病原菌偵測新藥研發360031II类应用：终点读板•基因突变分析–单基因遗传病诊断，如血友病、地贫•SNP扫描–疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定–SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异–药物副反应的预防，如麻醉意外•物种鉴定、菌株鉴定–各种病毒，细菌，病毒–病原体检测，如炭疽菌，Ecoli.O15732荧光定量PCR的临床应用•遗传疾病的早期诊断肿瘤的诊断•抗病毒药物疗效的观察、指导•病情评估和预后判断•新药验证输血源的筛选•母婴传播的控制与观察同步定量PCR在醫學和生物學领域的全方位應用-基因定量：癌症基因及免疫基因之定量-病原菌偵測：Salmonella，EcoliO157-病毒偵測：HBV，HCV等-GMO檢測-SNPGenotyping定量病人血漿中的EBV病毒1999，香港中文大學病理系，Dr.DennisLo研究结论：EBV是導致鼻咽癌的主因之一實驗結果:1.96%的病人可被偵測得到EBV之存在2.鼻咽癌晚期的EBVDNA量比早期較高3.放射線治療後,EBVDNA無法被偵測4.ABI7700定量PCR方法可應用於監測療程中之病毒量變化偵測HCV之病毒量--1999，Dr.TomokoTakeuchi，Japan--HCV是導致肝病變的原因之一--實驗結果:a.98%的病人於慢性肝炎期可被偵測到HCV之存在b.95.8%的病人於肝壞疽期可被偵測到HCV之存在c.100%的病人於肝細胞腫瘤期可被偵測到HCV之存在d.利用干擾素治療前後來偵測HCV病毒之改變量偵測病人痰中的肺結核桿菌量--1998，Dr.L.E.desjardin，USA--Mycobacteriumtuberculosis是導致肺結核(TB)的主因之一,而病人經抗結核桿菌治療後,仍長期出現在痰中--實驗結果:a.偵測TBIS6110targetgeneb.傳統瓊酯膠培養耗日廢時(6~8週)c.可用來定量早期肺結核的量偵測病人活體組織與子宮頸抹片的HPV病毒量--1999，Dr.AgnethaJosefsson，Sweden--人類乳突狀病毒(HPV)是導致子宮頸癌的幫凶,臨床症狀顯示,有HPV感染者,未必罹患有子宮頸癌,但罹患有子宮頸癌之患者,90%有HPV感染--實驗結果:a.針對HPVtype16,18,31,33,35,45進行篩檢欢迎联系AB公司资料查询：英文原版操作手册、说明书下载基因定量和SNP引物探针试剂盒查询全国维护中心电话：8008100192欢迎联系AB公司资料查询：英文原版操作手册、说明书下载基因定量和SNP引物探针试剂盒查询全国维护中心电话：8008100192