细菌和链霉菌的分子克隆载体

第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体一、革兰氏阴性菌克隆载体1.移动载体（mobilizablevector）1)特点i.广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围ii.DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化2)结构i.RK2质粒的结构a.oriVDNA复制起点b.DNA复制基因c.DNA转移基因d.oriTDNA转移基因e.药物抗性基因（AprKanrTcr）RK2(56kb)TraTraKanrTraTrfAOriVTrfBrlxTcrAmprpNJ5073(50kb)HindIIIHindIIITrpEtmpstrTcrPstITcrBglIIEcoRIpRK290(20kb)SalIG+菌的质粒和载体ⅱ.移动载体与辅助质粒pRK2013:将RK2中的全部转移基因和Kanr基因插入到E.coli的colE1质粒中构成辅助质粒pRK290:余下部分（Apr除外）构成移动载体（约20Kb）*当选用E.coli为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将E.coli细胞与其他G‐细胞混合，在pRK2013的作用下，pRK290可接合转移至终宿主细胞。3)不相容群（incompatibilitiygroup）克隆载体ⅰ.P群：RP4RK2RP1R682-5拷贝ⅱ.Q群：R300BRSF1010R116215-20拷贝ⅲ.W群：Sa2-5拷贝4）遗传标记基因大多数为抗生素标记基因，要注意不同G‐菌中的表达活性辅助质粒重组质粒供体细胞受体细胞接合DNA转移G-细菌中重组质粒的转移2.非移动载体(non-mobilizablevector)1)特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体2)实例：P4D0105-由E.coli噬菌体P4构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。ⅰ.当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。ⅱ.该载体含有一个virl突变和在引物酶基因α中存在一个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。XhoIKanrcosVir1P4D0105TcrSalIαP4D0105载体的结构二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体1.枯草杆菌克隆载体1）B.subtilis作为宿主菌的优点ⅰ.芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程ⅱ.遗传背景较清楚，可直接导入外源DNAⅲ.非致病细菌，因而安全ⅳ.研究结果可用于其它芽孢杆菌ⅴ.存在各种分泌蛋白质2）B.subtilis作为宿主菌的缺点ⅰ.存在多种蛋白酶基因和相应产物ⅱ.外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应3)克隆载体ⅰ.复制子来源i)质粒DNA质粒名称大小(kb)标记基因拷贝数来源pUB4.5Kanr50金黄色葡萄球菌pE1943.7Eryr10同上pC1942.9Cmlr同上pSA05014.1Strr20-50同上pBC61蜡状芽孢杆菌pLS103B.subtilispFTB14淀粉液状芽孢杆菌pAB124Tcr嗜热脂肪芽孢杆菌pTB1925.8KanrTcr同上pT1814.4Tcr蜡状芽孢杆菌pCW7同上pAMα1S.faecalisii)噬菌体Ф10539.2kbB.subtilis温和噬菌体Q1190kb同上SECEEEEEBgIIESKEEBgIIEcosφ105dcmR(26kb)φ105(39.2kb)Ecos当外源DNA插入上述载体时，Ф105生长的功能丧失,当重组DNA分子转入已含有Ф105的溶源化菌株时，重组DNA分子可以十分有效地插入染色体DNA中。这种技术称之为原噬菌体转移技术φ105载体+转化或感染原噬菌体DNA溶源化菌株染色体DNA同源重组具插入DNA的原噬菌体不再形成噬菌斑ii.标记基因ⅰ)抗生素抗性基因ⅱ)thy基因(三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便能存活iii.表达载体的启动子常用的有液化芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子和sp2启动子2.其它G+克隆载体1)枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌2)嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体三、链霉菌克隆载体1.质粒载体质粒名称大小(kb)来源宿主范围拷贝数SLP1.214.5天兰色链霉菌窄谱,变青链霉菌4-5SCP2(性因子)″″″1-3pIJ1018.9变青链霉菌广谱(各种载体构建)40-300pFJ10320S.granulorubor生二素,金霉素,弗氏链霉菌pUC69.2S.cepinosue广谱30-402.噬菌体载体ΦC31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41kb，其中32kb是必须的,具粘性末端的线状DNA分子，可插入约10kb外源DNA，可裂解和溶源化生长。3.标记基因杂合致死（lethalzygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选择。转化菌落变青链霉菌第四节真菌分子克隆载体一、酿酒酵母(Saccharomyceacerevisiae)的分子克隆载体1.克隆载体的种类1)按复制方式划分i.自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分i.附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒ii.染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)TELURA32μAmprTcrURA3YIpYEpYRpYLppYACAmprAmprAmprAmprTcrTcrTcrTcrURA3OriOriOriOriCENYCpAmprTcrURA3OriTRP1HIS4TELTELTEL2μURA3AmprTELARS酿酒酵母载体的种类和构建*若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体YCp-YeastCentrometricplasmid**若在YCp或YRp中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为YLp-YeastLinearplasmid***若将YLp质粒构建成环状分子,该质粒称之为pYAC载体(YeastArtificialChromosome)3)标记基因大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如ARG4，LEU2，TRP1，HIS3和URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在E.coli的转化体中来鉴别的。2.酵母克隆载体的结构与特点1)穿梭载体，YIp除外2)有适合两种生物的标记基因3)环状或线状DNA详见下表载体类型存在方式所需DNA序列标记基因转化频率稳定性（菌落/μgDNA）无丝分裂有丝分裂整合型整合与染色体DNAAprTcr10+a+a(YIp5)1-几个拷贝同源URA3附加体型自主复制2μ质粒AprTcr103-104-b-c(YEp13)多拷贝LEU2复制型自主复制ARSAprTcr103-104-b-c(YRp7)多拷贝TRP1着丝粒型染色体状ARS,CENApr103-104+d+d(YCp19)通常单拷贝TRP1,URA3线型染色体状ARS，CENTRP1，HIS3103-104+e+(YLp21)通常单拷贝TELa.每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来b.在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNAc.非孟德尔式分离，主要是4+：0-d.无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%酿酒酵母各种载体的特征3.YIp载体该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源DNA整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但也可能发生第二次同源重组(见图)。可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如图所示）。123456789105326532664IIIIIII.宿主DNA;II和III.转化子DNA(10道除外);I和II.LEU基因为探针;III.pBRDNA为探针;E1/道1,4,7;E2/道2,5,8;E1-E2/道3,6,9和10.假设上述YIp质粒长6kb,E1-E2双酶切得2kb和4kb两片段;宿主菌染色体上标记基因用E1酶切得5kb片段,用E2酶切得3kb片段.YIp载体和杂交示意图OriE2E1E2E2E1E1OriLEU2E2E1Leu+Leu-OriE2E1整合降解E1E2E1E1E2E2E2E2E1E1Leu+Leu-同源重组LEU2LEU2载体的整合和重组4.YRp载体1）酵母染色体复制子和ARS的保守性酵母染色体总长为15,000kb,根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有480个ARS。2）YRp的特点i.高频转化ii.转化子不稳定iii.子代细胞质粒分散不均匀iv.从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒DNAv.可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同。YRp12(6.9kb)oriTcrEEPB33111234YRp载体和杂交示意图1-YRp12探针;2-URA3探针;3-ARS探针;4-pBR322探针假设宿主菌染色体的ura3基因酶切得3kb片段,而ARS片段酶切得1kb片段.3）YARp载体（酵母非着丝粒复制质粒）1.4kb酵母DNA（EcoRI片段）自我连接而成，该质粒含有ARS1和TRP1基因该质粒特点:i.高拷贝,100-200/cell;ii.比YRp质粒稳定;iii.可形成核小体;iv.减数分裂以4+:10分离EEHARS1TRP1ARS1TRP1YAR质粒的结构5.YEp载体1)酵母2μ质粒i.结构ii.结构特点REP1REP3REP2oriFLPPHHEREP1REP3REP2oriFLPPHHEBformAform2774bp599bp51bp51bp16bp16bp16bp16bp11bp11bp13bp13bp122bp1072294002291782μ质粒的结构2μ质粒倒置区的同向和反向重复片段2）2μ质粒载体YIp中可插入整个或部分2μ质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有2μ质粒，YEp复制所需的酶可由2μ质粒提供。YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2μ质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即[Cir+][Ciro]当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图谱（设YEp为8kb，BamHI有一单切点）YEp13(10.7kb)Tcrori2μ2μEEPB123410.710.710.76.33.53.51-YEp13探针;2-2μ质粒探针;3-LEU2探针;4-pBR322探针6.YCp载体第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体,现已从酿酒酵母菌中分离到多个着丝粒,它们具有如下保守序列:足迹分析技术表明,着丝粒中有一个200-250bp的免受核酸酶作用的DNA序列,可分为四个区。各着丝粒间不发生交叉杂交。YCpR1CEN3galKCEN3ATAAGTCACATGATTGATTTCCGAATTTAGAGCAACEN11------------------------------------------------------------------------CEN6------------A---A---A---------T---