药学分子生物学 第四章

第四章RNA转录(RNAtranscription)1.基本概念2.原核生物RNA转录的起始3.真核生物RNA转录的起始4.转录的延伸5.转录的终止6.原核生物转录产物的后加工7.真核生物转录产物的后加工8.真核生物转录产物中内元的去除9.不连续转录和反式拼接第一节基本概念转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。若干基本概念是基因表达的第一步，也是最关键的一步。以DoubleStrandDNA中的一条单链作为转录模板(杂交实验所证实)•有义链(sensestrand)[又称编码链codingstrand]:指不作模板的DNA单链•反义链(antisensestrand)[又称模板链templatesrand]:指作为模板进行RNA转录的链在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录A＝U、C≡G合成RNA分子转录合成RNA链的方向为5’→3’，模板单链DNA的极性方向为3’→5’，而非模板单链的极性方向与RNA链相同，均为5’→3’。（书写）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA为模板,RNA聚合酶的结合)RNA的转录包括promotion.elongation.termination三过程从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单位(transcriptionunit)(转录起始点)原核生物的转录单位多为polycistroninoperon,真核生物中的转录单位多为monocistron,Nooperon转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游记为正值upstreamstartpointdownstream－10＋1＋10第二节原核生物RNA转录的起始两个相关概念:＊操纵元(operon):是原核生物基因表达调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子ipozyaNolacmRNAAbsenceoflactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresenceoflactoseInactive•启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。(频率、效率)一、原核生物的RNApolymerase(E.coli)1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ’ααCoreEnzymeβααβ’σHoloEnzyme(1)全酶（HoloEnzyme）•用于转录的起始•依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化)•专一性地与DNA序列(启动子)结合•结合常数：1014／mol•半衰期：数小时（107／mol1秒以下）•转录效率低，速度缓慢（σ的结合）（2）核心酶（CoreEnzyme）•作用于转录的延伸过程（终止）•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）•非专一性的结合（与DNA的序列无关）•结合常数：1011／mol•半衰期：60秒此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能（1）σ因子•σ因子可重复使用•修饰RNApol构型•使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox(－35区),并通过σ与模板链结合2α＋βα2ββ’＋σα2β＋β’α2ββ’σ（3）全酶的组装过程•不同的σ因子识别不同的启动子E.coli中有五种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28、σ24）枯草杆菌中有11种σ因子（σ因子的更替对转录起始的调控）（2）α因子•核心酶的组建因子•促使RNApol与DNA模板链结合α＋α2α＋βα2β＋β’•前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链•尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链（3）β因子•促进RNApol＋NTPRNAelongation•完成NMP之间的磷酸酯键的连接•Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基）•与Rho（ρ）因子竞争RNA3’－endEsite（elongationsite.RifR）:对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）（4）β’因子•参与RNA非模板链（sensestrand）的结合（充当SSB）•构成Holoenzyme后，β因子含有两个位点Isite（initiationsite.Rifs）:该位点专一性地结合ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点有义DNA链结合位点（β’亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）双链DNA解链位点（前端α亚基提供）单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）σ因子作用位点E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD二、启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）1、启动子由两个部分组成（1）上游部分—CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白（2）下游部分—RNApol的进入（结合）位点－35~－10包括识别位点和结合位点（RB位点）2、RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama框（SextamaBox）§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点，§RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点—识别位点（R位点）§大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol的σ因子）§位置在不同启动子中略有变动（2）Pribonow框（PribonowBox）§-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点结合位点（B位点）§一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）§位置范围－4到－13因此又称TATABox保守T（3）起始位点（initiationsite）：＋1位点RNA聚合酶的转录起始位点起始NTP多为ATP或GTP起始过程：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被σ因子发现并结合）b、开放型启动子复合物的形成§RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡状物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合§开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向§两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）c.在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（β亚基）三元复合物形成+1位多为CAT模式,位于离开保守T6~9个核苷酸处---6-9bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence（4）σ因子解离→核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程转录的起始过程σ核心酶12～17bp（β亚基）3、CAP-cAMP结合位点（也称CAP位点）转录调控中，I→阻遏蛋白→负调控lac操纵子模型I许多基因的表达还存在正调控机制例如:E.coli培养基中乳糖和葡萄糖共存时→只有葡萄糖被利用原因：CAP位点的正调控•葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将ATP→cAMP，cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能与RNApol结合•葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAP－cAMP与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结合RNApol因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才能进行转录。（对lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成（－70～－40）位点Ⅰ：－70～－50包括一个IR序列强结合位点位点Ⅱ：－50～－40弱结合位点位点Ⅰ对位点Ⅱ具有协同效应（cooperativity）（2）位点Ⅱ结合CAP－cAMP复合物后，促使RNApol进入SextamaBox,最终与－10序列结合起始转录原因：CAP－cAMP复合物与位点Ⅱ结合→SextamaBox富含G·C区域（G·C岛区）稳定性降低→PribnowBox的溶解温度降低→促进开放型启动子复合物的形成→促进转录4、启动子各位点与转录效率的关系（1）－35序列与－10序列与转录效率的关系标准启动子－35TTGACA－10TATAAT则不同的启动子a.与标准启动子序列同源性越高→启动强度越大b.与标准启动子同源性越低→启动强度越小c.与标准启动子差异很大时→由另一种σ因子启动原因:•－35序列通过被σ因子识别的容易→决定启动子强度•－10序列影响开放型启动子复合物形成的速度→决定启动子强度（2）－35序列与－10序列的间隔区与转录效率的关系◆碱基序列并不重要◆间距非常重要，17bp的间距转录效率最高◆间距上的突变种类：间距趋向于17bp→上升突变间距远离17bp→下降突变•启动子上升突变、启动子下降突变第三节真核生物RNA转录的启动一、真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApolⅠ最不敏感（动、植、昆）RNApolⅡ最敏感RNApolⅢ不同种类（物种）的敏感性不同2、位置和转录产物RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录hnRNA（mRNA前体，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）snRNA（核内小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核质负责tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA•目前在线粒体和叶绿体内发现少数RNApol（活性较低）二、真核生物的启动子三种RNApol→三种转录方式三种启动子→三类基因，Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类1、RNApolⅡ的启动子•结构最复杂•位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成•通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（capsite）：转录起始位点与Prok.的“CAT模式”相似（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）•位于－30处•一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）•定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框）•TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（CAATbox）•位于－75bp处•一致序列为GGC/TCAATCT•前两个G的作用十分重要(转录效率)•增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性（距转录起始点的距离，正反方向）☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在（4）增强子（enhancer）（又称远上游序列farupstreamsequence）•在－100以上•SV40的两个正向重复研究得最清楚（DR）-107~178、－179~－250各72bp•该增强子的特点如下：♪对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖的情况♪距离效应:离72bp越近的容易起始转录♪极性效应：转录方向离开72bp的起始序列优先转录♪细胞类型的选择：不同类型中作用有差异表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（5）GC框（GCbox）•位于－90附近，较常见的成分•核心序列为GGGCGG•可有多个拷贝，也可以正反两方向排列（6）其他元件•八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）一致序列为ATTTGCAT•KB元件一致序列为GGGACTTTCC•ATF元件一致序列为GTGACGT•还有一些位于起始点下游的相关元件（7）不同元件的组合情况不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异例如：SV40的早期启动子中有6个GC框2、RNApolⅢ启动子结构（1）分为