细胞因子的检测和应用

细胞因子的检测及应用发展历史和命名•1966年-巨噬细胞移动抑制因子•1969年提出了“淋巴因子”的概念•此后，又提出了“单核因子”的概念•(由于如此众多的免疫活性因子的发现，且鉴于对其本质尚不清楚，均以其生物学活性命名，致使这些因子的名称相当混乱。)•1979年在瑞士召开的第二届淋巴因子国际会议上提出了白细胞介素的概念,并按发现顺序以阿拉伯数字排列。•尚有其它细胞分泌的活性介质，如IFN-α和IFN－β分别由白细胞和纤维母细胞产生。目前将所有这些因子统称为细胞因子。概述•概念细胞因子（cytokine）是指由活化的免疫细胞（包括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免疫效应物质。•产生细胞因子的细胞种类很多，但归纳起来主要有三类：①活化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核／巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；②基质细胞类，包括骨髓和胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢神经系统的小胶质细胞等；③某些肿瘤细胞系。•产生：抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因子的产生，各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。•共同特点•1)正常休止状态的细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌CKs,细胞内无细胞因子前体储存,接受刺激后从激活基因开始至合成,分泌,刺激结束后细胞因子的产生随即停止.。•2）绝大多数CKs均为低分子量（4～80kD）的糖蛋白。•3）分泌特性：大多数的CKs是通过旁分泌（paracrine），或自分泌（autocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细胞或靶器官；•4）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。•5）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。•6）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，是免疫球蛋白等分子远不能及的。•7)非特异性:细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产生,但其对靶细胞发挥功能却为非特异性,也不受MHC限制.•3．分类•白细胞介素（interferon）IL•干扰素（interferon）IFN•肿瘤坏死因子（TNF）•集落刺激因子（CSF）•生长因子（growfactor）GF•趋化因子细胞因子检测受体检测技术生物学细胞增殖靶细胞杀伤趋化活性诱导产物细胞病变抑制分子生物学DNARNA检测ELISA免疫学流式细胞技术生物学检测法(1)细胞增殖法•依赖细胞株：许多细胞因子具有细胞生长因子活性，利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量成正比。•除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。3H-TdR掺入法•原理：将3H-TdR作为DNA合成的原料掺入到新增殖的细胞中，细胞DNA合成的增加或减少而间接判断细胞增殖的方法，而用放射物质标记的胸腺嘧啶则可代表细胞DNA的增值程度，通过与细胞因子标准品比较，而推算出待测标本中细胞因子的含量。步骤：1．依赖细胞株的培养。用血细胞计数仪测定细胞密度，取适当体积的细胞用于测定。用基础培养液洗细胞两次后，测定细胞活力（应80%），并以测定培养液重悬细胞至合适终浓度用以测定。表１５－１提供了参考。２．用细胞因子标准品建立一个标准曲线，并设置已知含测定培养液的质控孔。３．适当稀释待测标本，加入微孔板中双份重复测定。４．每孔中加入细胞悬液，置于湿润的CO2培养箱中３７℃培养。（培养时间按所用细胞株而定）５．加入3H标记的胸腺嘧啶，在置于CO2培养箱中３７℃培养约4h。６．收集细胞于玻璃纤维滤纸上，是用液体闪烁仪测定放射活性。此方法优点是易于自动化，测定的信噪比最好，可常规用于大标本量的测定。缺点是使用放射性核素，试验废物处理麻烦。MTT法•MTT（四唑盐）比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT。•原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长620nm进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。•优点：灵敏度高，操作简便，自动化。•缺点：影响因素多，重复性较差。•注意：MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。(2)靶细胞杀伤法根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素方法或颜料染色等方法判定细胞的杀伤率。一般活细胞的检测可采用染料甲紫、萘酚蓝黑、MTT等使细胞着色，再用脱色液将燃料脱出，然后用酶标仪比色来反映细胞存活状态。培养孔特定细胞株加入TNF37℃MTT酶标仪比色吸光度与细胞因子的量成反比，用细胞因子标准品稀释度作线性曲线，便可得到特定细胞因子的含量。(3)趋化活性测定法本法主要用于趋化因子和IL-8的生物学活性测定。趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的趋化性（chemotaxis）和化学增活性（chemokinesis）。趋化性指趋化因子诱导细胞有趋化因子浓度低的地方向浓度高的地方移动的特性，可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定；化学增活性是指其增强细胞运动能力的特性，可采用琼脂糖小滴化学动力学实验测定。3~5μm孔径的微孔滤膜靶细胞滤液受检的趋化因子３７℃温育数小时取膜固定、干燥、着染、脱色将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在膜内通过距离，求其趋化单位滤膜微孔小室法细胞悬液对照培养液趋化因子或待测液将含小牛血清的1%琼脂糖倾于平皿，如上图操作后经３７℃温育后，用2%戊二醛固定，除去琼脂糖层，经染色后，测量细胞运动的距离，计算移动指数。移动指数=趋化移动距离/任意移动距离琼脂糖平板法(4)细胞因子诱导的产物分析法•某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、IL-6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性(5)细胞病变抑制法•病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便制得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此尽管细胞因子的种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法有ELISA、RIA及免疫印迹法等。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。流式细胞技术flowcytometry•可以测定单个细胞因子产生特性。•原理：荧光素标记的细胞因子特异的单克隆抗体，在一定条件下，与活化的靶细胞内的特异细胞因子结合，然后用流式细胞仪分析荧光标记的阳性细胞百分率和平均荧光强度，其与细胞内细胞因子的含量成正比。流式细胞术检测细胞内细胞因子cytokinesincellDetectionbyflowcytometry•分离待测细胞•活化细胞（莫能菌素（monensin)和布雷菲尔德菌素）•封闭细胞表面Fc受体（脱脂奶）•细胞表面抗原染色•固定和通透细胞膜（多聚甲醛）•细胞内细胞因子染色•流式细胞分析分子生物学检测法(DNA)１．提取细胞基因组的DNA，将其用限制性核酸内切酶切，２．再做琼脂糖凝胶电泳将酶切DNA片断分离，３．将经变性的DNA片断转移到硝酸纤维素膜上，４．用相应细胞因子的核酸探针来检测其特定DNA序列结构。可进行基因的定性及定量、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RLFP）等。SOUTHERNBLOT重物500g吸水纸滤纸转移膜凝胶滤纸杂交缓冲液玻璃支撑Southernblot分子生物学检测法聚合酶链反应（PCR）•PCR可用于检测细胞因子基因有无缺失、突变，当有缺失时则缺少扩增的DNA片断，而当基因突变时可产生新的酶切位点或原有的内切酶位点丧失，经RLFP或PCR结合序列特异寡核苷酸探针斑点杂交分析可发现突变的基因，如严格控制杂交及洗膜条件，可发现单个碱基的突变；还可应用PCR结合序列特异引物及上述两种方法检测某些细胞因子的多态性。实时荧光PCR技术•特点：实时（realtime)测定，靶核酸扩增和产物检测同时完成，扩增管在整个测定过程中完全处于闭管状态，不容易出现扩增产物对实验室的“污染”，对实验技术人员的测定操作及实验室设置的要求都相对要低一些。TaqMan技术“分子信标”技术TaqMan技术oCH2OPOH5’端标记报告荧光3’端标记淬灭荧光没有杂交，距离近而发生荧光能量转移样本中原始模板的数量与荧光强度超出选定阈值时的扩增循环数（Ct)成反比TaqMan聚合酶“分子信标”技术5’3’分子生物学检测法(mRNA)•Northern印迹杂交本方法有一定的限制性，因为mRNA的稳定性及其降解速率直接影响细胞内mRNA的积累量，因此用细胞总RNA作Northern印迹杂交，其结果不能完全反映mRNA的转录活性。•反转录PCR（RT-PCR）细胞因子的mRNA寿命短、拷贝数低，难以在小量样本中进行检测。RT-PCR能检测细胞内低丰度特异mRNA的方法。•原位杂交将标记的特异DNA或RNA探针与细胞内染色体上相应的DNA形成稳定的杂交体。此法可用于细胞因子基因的组织细胞及染色体定位。•原位PCR原位杂交的应用受到其敏感性的影响，而细胞因子的基因均为单拷贝，有时不能被检出。原位PCR就是以特定的DNA或RNA为模板，在细胞核内原位进行扩增。而扩增产物因分子较大，或互相交织，不宜透过细胞膜而保留在原位。在应用原位杂交技术将其检出。细胞因子受体检测技术细胞因子的生物学活性是通过其相应的受体发挥作用的，细胞因子受体检测已成为基础和临床免疫学研究的重要内容。本节主要介绍细胞因子受体检测的基本方法。•活细胞吸收试验将过量的待测细胞与有限的细胞因子共育，若细胞膜表面存在相应的受体即可吸收细胞因子，通过测定回收后细胞因子生物活性丧失情况可确定受体是否存在。此法简便，适用于定性。细胞因子受体检测技术•放射性核素标记重组配体的放射受体分析本方法是确定细胞受体分布及其特性的主要方法，可测定受体的数量及亲和力。通常采用放射性核素示踪，如体外标记重组细胞因子，通过生物合成的标记重组细胞因子的功能不受影响，•受体单克隆抗体标记分析技术抗细胞因子受体的McAb既可封闭受体抑制相应细胞因子的生物活性，也可用标记的McAb直接做免疫放射受体分析或免疫共沉淀。细胞因子受体检测技术•受体cDNA分析•酶免疫技术检测法某些细胞因子受体除存在于细胞膜外，尚可分泌进入体液，称为可溶性细胞因子受体（solublecytokinereceptor）,如sIL-2R、sIL-4R和sIFN-γR。这类受体多采用ELISA法检测。•重组细胞因子与受体的交联分析利用化学交联剂将标记的重组细胞因子与膜受体交联，细胞裂解物经PAGE电泳后作放射自显影分析，通过带型分析可确定受体的分子量及亚单位。三种细胞因子测定方法的比较•生物学检测法：比较敏感，直接测定生物学功能，可靠，但需培养依赖性细胞株、耗时长、步骤繁，影响因素多，不易掌握。•免疫学检测法：操作较简便、快速、重复性好、尚可测定特定细胞或亚群产生细胞因子的含量，但敏感度比生物学法低10~100倍。免疫学检测法检测的是细胞因子蛋白质的抗原性，可能是无活性的变性分子或细胞因子的裂解片断。•分子生物学检测法：只能代表基因表达情况，不能提供细胞因子的浓度及活性等