自学内容2---分子杂交技术

分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA（一）印渍技术Blotting•首先由EdwenSouthern在1975年提出。•Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质上并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测。二、印渍技术的类别及应用•DNA印迹技术Southernblotting•RNA印迹技术Northernblotting•蛋白质印迹技术Westernblotting•斑点印迹Dotblotting•原位杂交insituhybridization•DNA点阵DNAarray•DNA芯片技术DNAchip（一）DNA印迹技术Southernblotting•又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。基本方法•将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；•经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。•附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心（二）RNA印渍技术Northernblotting•又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。•主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。（三）蛋白质印渍技术Westernblotting•又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。•应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。三种印迹技术的比较（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。Southern杂交的主要步骤•待测DNA样品的制备、酶切•待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳•凝胶中DNA的变性：碱变性•Southern转膜：–硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜–毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法•探针的制备•Southern杂交•杂交结果的检测Northern印迹杂交(Northernbloting)•检测RNA（主要是mRNA）的方法•与Southern杂交的不同–靶核酸：RNA–RNA电泳–转膜：不需变性Western杂交印迹法(Westernbloting)•检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法•主要步骤：–蛋白质样品的制备–聚丙烯酰胺凝胶–蛋白质的电转移：尼龙膜–靶蛋白的免疫学检测•靶蛋白于第一抗体（一抗）反应•与标记的第二抗体（酶标二抗）反应•显色反应：酶促反应斑点印迹Dotblotting•斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。原位杂交insituhybridization•即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。•因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要生物学和病理学意义。原位杂交(insituhybridization)•将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。•特点–能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究–不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高–能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤•细胞或组织的固定：载玻片•组织细胞杂交前的预处理–用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质•探针的选择和标记•杂交•杂交结果检测FISH（fluorescenceinsituhybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。探针技术probe•将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来探针的标记•探针的种类–cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针•标记物–核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等–非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等•探针标记方法–缺口平移法(nicktranslation)–随机引物法(randomprimer)：六核苷酸残基的引物–PCR标记法–末端标记法•探针的纯化蛋白质相互作用研究技术ResearchTechnologyofInteractionofProtein蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质之间相互作用研究的重要性酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术常用DNA和蛋白质相互作用的研究技术:DNA凝胶阻滞试验DNaseⅠ足迹试验•DNA迁移率变动试验(DNAmobilityshiftassay)，又叫凝胶阻滞试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊凝胶电泳技术.•基本原理为:在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳。若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白.•DNaseⅠ足迹试验:足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，基本原理是蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带.•表达序列标签技术（EST，ExpressedSequenceTags）:此技术以大规模cDNA测序为基础，即提取生物体的mRNA，进一步获得cDNA文库，挑选其中300—500bp的部分（即EST序列）进行序列测定，然后通过生物信息学手段得到全长的基因序列。通常EST序列位于一段cDNA的3’—端非翻译区，也可以在该cDNA中随机选取。利用EST技术克隆基因及功能分析，使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。•基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术(ES)和同源重组技术的基础之上，首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。•经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。目前，在ES细胞进行同源重组己经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。