73生物传感器

第三节生物传感器第二章直接参数检测一、生物传感器的基本概念生物传感器通常是指由一种生物敏感部件和转化器紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法，也是对物质在分子水平上进行快速和微量分析的方法。（一）生物传感器工作原理待测物质经扩散作用进入固定生物膜敏感层，经分子识别而发生生物学作用，产生的信息如光、热、音等被相应的信号转换器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。转换器敏感元件待测物1生物传感器的模型是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。应用领域：环境监测、食品分析、生物医学、发酵工业等敏感元件：酶、抗体、核酸、细胞等。转换器：电化学电极、光学检测元件、场效应晶体管、压电石英晶体、表面等离子共振。酶(Enzyme)抗体(Antibody)DNA2生物传感器的组成3转化器转化为电信号的方式（1）将化学变化转变成电信号酶传感器为例，酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减，用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器，常用转换装置有氧电极、过氧化氢。（2）将热变化转换成电信号固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化。例如大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围.这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化，后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。（3）将光信号转变为电信号例如，过氧化氢酶能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光，如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端，再和光电流测定装置相连，即可测定过氧化氢含量。还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生荧光，也可以用这种方法测定底物浓度。鲁米诺鲁米诺(luminol)，又名发光氨。化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼，化学式为C8H7N3O2，结构式见右图，1853年就被合成出来了。1928年发现它被氧化时能发出蓝光。主要用于现代刑侦的的血液检测，能检测只有百万分之一含量的血，即使滴一小滴血到一大缸水中也能被检测出来。过氧化氢变成水和单氧，单氧再氧化鲁米诺让它发光。上述三原理的生物传感器共同点：都是将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应，将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量，这种方式统称为间接测量方式。（4）直接产生电信号方式这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接(或通过电子递体的作用)在电极表面上发生。根据所得的电流量即可得底物浓度。（二）生物传感器发展历程开端于20世纪60年代。1962年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果，可认为是最早提出了生物传感器(酶传感器)的原理。1967年Updike等人实现了酶的固定化技术，研制成功酶电极，这被认为是世界上第一个生物传感器。20世纪70年代中期后,生物传感器技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究,并获得了较快的进展，如Divies首先提出用固定化细胞与氧电极配合，组成对醇类进行检测所谓“微生物电极”。1977年,钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告，并在微生物传感器对发酵过程的控制等方面，作了详细报导，正式提出了对生物传感器的命名。1根据输出信号产生的方式生物亲和型、代谢型、催化型2根据生物分子识别元件上的敏感物质酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器、基因传感器等3根据信号转化器电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等4其他分类被测对象、大小、功能（三）生物传感器分类（1）生物亲合型传感器被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有生物亲合作用，即二者能特异地相结合，同时引起敏感材料的分子结构和/或固定介质发生变化。例如：电荷、温度、光学性质等的变化。反应式可表示为：S（底物）+R（受体）=SR（2）代谢型传感器底物（被测物）与分子识别元件上的敏感物质相作用并生成产物，信号转换器将底物的消耗或产物的增加转变为输出信号，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为：S（底物）＋R（受体）=SR→P（生成物）上面介绍的各种名称都是类别的名称，每一类又都包含许多种具体的生物传感器。例如，仅酶电极一类，根据所用酶的不同就有几十种，如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸电极、丙酮酸电极等等。就是葡萄糖电极也并非只有一种，有用pH电极或碘离子电极作为转换器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极等。实际上还可再细分。（四）生物传感器组成部分一是生物分子识别元件(感受器),是具有分子识别能力的生物活性物质(如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、有机物分子等);二是信号转换器(换能器),主要有电化学电极(如电位、电流的测量)、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。（五）生物传感器优点1根据生物反应的特异性和多样性，理论上可以制成测定所有生物物质的传感器，因而测定范围广泛。2一般不需进行样品的预处理，它利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂，使测定过程简便迅速，容易实现自动分析。3体积小、响应快、样品用量少，可以实现连续在位检测。4通常其敏感材料是固定化生物元件，可反复多次使用。5准确度高，一般相对误差可达到1%以内。6可进行活体分析。7传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪，因而便于推广普及。8有的微生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生，能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。二、生物传感器的信号转换器生物传感器中的信号转换器是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可用信号的装置。生物传感器的信号转换器已有许多种，其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电化学电极，用它组成的生物传感器称为电化学生物传感器．可用作生物传感器的信号转换器的电化学电极，一般可以分为两种类型。电位型电极和电流型电极．（一）电位型电极1离子选择电极离子选择性电极是一类对特定的离子呈选择性响应的电极，具有快速、灵敏、可靠、价廉等优点，因此应用范围很广．离子选择性电极作为生物传感器的信号转换器只是它的一种应用，在生物医学领域也常直接用它测定体液中的一些成分（如H+，K+，Na+，Ca2+等）。2氧化还原电极氧化还原电极是不同于离子选择电极的另一类电位型电极。（二）电流型电极电化学生物传感器中采用电流型电极为信号转换器的趋势日益增加，这是因为这类电极和电位型电极相比有以下优点：（1）电极的输出直接和被测物的浓度呈线性关系，不像电位型电极那样和被测物浓度的对数呈线性关系。（2）电极输出值的读数误差所对应的待测物浓度的相对误差比电位型电极的小。（3）电极的灵敏度比电位型电极的高。1氧电极有不少酶特别是各种氧化酶和加氧酶在催化底物反应时要用溶解氧为辅助试剂，反应中所消耗的氧量就用氧电极来测定。此外，在微生物电极、免疫电极等生物传感器中也常用氧电极作为信号转换器，因此氧电极在生物传感器中用得很广。目前用得最多的氧电极是电解式的Clark氧电极，Clark氧电极是由铂阴极、Ag/AgCl阳极、KCl电解质和透气膜所构成。当将氧电极插入含有溶解氧的溶液后，溶液中的O2将扩散，透过透气膜到达铂阴极表面被还原，还原电流值与溶解氧的量有关。（三）离子敏场效应晶体管（ISFET，ion-sensitivefieldeffecttransistor）由于电化学理论和半导体理论的相互渗透。所以出现了一类能够对离子或分子敏感的半导体器件，并称之为化学敏感半导体器件。其中对离子敏传感器件研究的成果较多．原理：三极管工作原理，制ISFET漏电流变化FET工作原理当栅极电压为正时，电场方向是由栅极经绝缘层指向基片，导电沟道内正电荷(空穴)被排斥走，负电荷(自由电子)被集中，形成N型导电沟道。电压变化，电场强度便改变，导电沟的电阻也发生变化，流经源极后漏极之间经导电沟道的电流大小也随之而改变。换一种说法：场效应品体管是利用外加在栅极上的电压所产生的感应效应来控制电流大小的。三、敏感器件（分子识别元件）（一）酶传感器(EnzymeSensor)1酶的活力单位（酶单位）（1）标准酶单位国际生物化学协会酶委员会规定了酶单位的标准形式为：一个酶单位（U）是在特定的条件下lmin内催化形成1μmol产物的酶量（或转化1μmo1底物的酶量）。特定条件一般是指选定的条件，如温度为25℃，30℃，37℃，最适pH，底物为饱和溶液。（2）酶的比活力每毫克蛋白质所含某酶的活力单位数称某酶的比活力。（3）酶浓度每毫升酶蛋白溶液所含某酶的活力单位数称某酶浓度。一定重量或一定体积酶制剂所具有的酶活力单位数叫做总活力。在酶的提纯过程中，总活力逐渐下降，比活力逐渐提高。（4）转换值也称分子活力或摩尔活力。其定义是1摩尔酶在最适条件下，1min内所转化的底物的摩尔数。转化值的单位为min-1，转换值的倒数是一个催化循环所需要的时间。固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。2酶的固定化技术固定化酶的研究已取得大量重要成果，发挥着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性酶比较具有以下优点：(1)极易将固定化酶与底物、产物分离；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5)较能适应于多酶反应。(6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。固定化细胞同时也存在—些缺点：(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性副产物的形成。(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。1酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法。如下图:（1）惰性载体——物理吸附法此法是酶分子通过极性键、氢键、疏水力或π电子相互作用等吸附于不溶性载体上。常用的载体有：多孔玻璃、活性炭、氧化铝、石英砂、纤维素酯（包括硝酸纤维素、醋酸纤维素）、葡聚糖、琼脂糖、聚氯乙烯、聚苯乙烯等。已用此法固定化的酶如：脂肪酶、α-D葡萄糖苷酶、过氧化物酶等。（2）离子载体—交换法选用具有离子交换剂的载体，在适宜的pH下，使酶分子与离子交换剂通过离子键结合起来，形成固定化酶。常用的带有离子交换剂的载体如下DEAE一纤维素（二乙氨基乙基纤维素）、TEAE一纤维素（三乙氨基乙基纤维素）、AE—纤维素（氨基乙基纤维素）、CM—纤维素（羧甲基纤维素）、DEAE一葡萄糖、肌酸激酶等。（3）活化载体—共价结合法a.重氮法b.迭氮法