核酸分子杂交(研究生课程)

第4章核酸分子杂交研究生课程NucleicAcidhybridyzation朱名安教授内容提要第二节核酸探针（Probe）第三节杂交类别与应用第一节分子杂交概念与基本原理第一节分子杂交概念与基本原理Concept&PrincipleofMolecularHybridization单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交（molecularhybridization）一、分子杂交概念变性复性DNA-DNA杂交双链分子二、分子杂交基本原理变性复性DNA加热变性DNA冷却复性DNA/RNA杂交Tm(meltingtemperature)：DNA从部分变性到完全变性是在一个很窄的温度范围内进行，这一温度范围的中点称为熔点温度。（一）DNA变性（denaturation）1、DNA变性某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。2、变性的方法（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛纯水等使双链核酸分子链间的氢键断裂。3、DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线DNA变性的基本过程（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.34、GC含量与Tm值之间的关系定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列两条单链都可形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。（二）DNA复性（renaturation）复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子三、影响杂交（复性）的因素1、核酸分子的浓度和长度浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1～0.5μg/ml,浓度过高影响杂交效率2、温度（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20～25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃3、离子强度（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度4、甲酰胺（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35～42℃杂交；（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交。5、核酸分子的复杂性（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同序列的总长度（２）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性6、非特异性杂交反应（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉第二节核酸探针（Probe）1、什么是探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。一、探针概念DNA探针是最常用的核酸探针，长度在几百bp以上的双链或单链cDNA片段（通常400—500bp）放射性或非放射性标记的RNA分子，用于探测与之互补的DNA或RNA链，RNA探针通常通过克隆相应DNA在体外转录合成而制备（通常400—500bp）RNA探针寡核苷酸探针一般有17-50个核苷酸组成，可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸二、探针种类理想标记物应具备的特性高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性三、探针标记物核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光。标记物种类四、探针标记方法随机引物标记DNA缺口平移标记全程RNA探针标记化学法全程标记3′末端标记5′末端标记随机引物标记—最常用DNA模板引物和模板DNA结合加入klenow片断、3种dNTP和1种标记dNTP引物延伸标记的DNA片段未标记的DNA模板DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP#DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）模板DNA切开模板DNA形成一到几个碱基的缺口掺入标记基团缺口平移DNA缺口平移标记在△处酶切在◆处酶切从T7启动子转录从SP6启动子转录全程RNA探针标记一、设计原理化学法全程标记(生物素或地高辛标记)与地高辛标记的探针杂交加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体加入底物BCIP/NBTCSPD一、设计原理末端标记3’-末端标记5’3’3’5’5’末端突出的DNA5’5’3’3’3’末端标记的DNA完整双链DNAKlenowDNA聚合酶32p—dNTP变性32p末端标记的单链DNA探针一、设计原理末端标记5’-末端标记乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-50微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针。五、探针的纯化第三节杂交类别与应用三种印迹技术的比较（一）液相杂交（二）固相杂交（三）原位杂交（四）基因芯片技术点杂交/狭缝杂交菌落杂交Northern杂交Southern杂交反点向杂交一、MASA液态芯片二、杂交的基本分类MASA是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应，并以100种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体，是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测。MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力二、杂交的基本分类概念：反向点杂交(reversedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，是将探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩增产物中是否含有目标基因的技术。二、反点向杂交原理与应用：RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特异性扩增的产物，在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交；待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。2.Southernblot3.Northernblot4.点杂交和狭缝杂交5.荧光原位杂交6.基因芯片1.菌落杂交三、固向杂交1.菌落杂交分子杂交实验①②③2.Southernblot2.SouthernblotDNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离膜上固定DNA片段在缓冲液中将标记的探针加到膜上DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上杂交信号的检测2.Southernblot1、裂解或破碎细胞2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段待测核酸样品的制备1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度胶2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记待测DNA样品的电泳分离凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性①具有较强结合核酸分子的能力②不影响与探针的杂交反应③与核酸分子结合稳定牢固④具有良好的机械性能非特异吸附少（2）常用的固相支持物①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上（2）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。（3）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA杂交结果检测1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针Southern杂交在医学中的应用1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNA3.Northern印迹杂交Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA4.点杂交和狭缝杂交DNA样品点到滤膜上1变性2中和3固定DNA4与标记探针杂交5洗脱与显影探针DNA探针标记变性将探针加到固定的DNA上1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量1）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交。5.原位杂交•保持组织细胞的形态•对核酸无抽提，修饰与降解作用•不改变核酸在组织细胞内的定位•不阻碍核酸与探针的杂交过程•对杂交信号无遮蔽作用•理化性质稳定2）杂交过程（1）组织或细胞的固定，理想固定液应具备：（2）组织细胞杂交前的预处理•去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质•组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复