农药制剂分析方法与农药残留实验室质量控制

第五章农药制剂分析方法与农药残留实验室质量控制一、CIPAC农药制剂分析方法准则（一）CIPAC简介国际农药分析协作委员会的英文简称是CIPAC，它是CollaborativeInternationalPesticidesAnalyticalCouncil的缩写,其官方网址是：，即欧洲农药分析协作委员会（1957）。1970年，更名为CIPAC，成为世界性组织并出版CIPAC手册第一版；1971在英国正式登记，是一个非盈利性组织。2.CIPAC的目标与任务CIPAC的目标与任务是促进农药产品分析方法以及制剂的物理化学试验方法取得国际间一致、促进实验室内部规范操作程序、资助旨在促进上述领域工作的会议、颁布标准化分析方法、加强与其它组织间合作。3.CIPAC会员组成CIPAC的正式会员一般为每个国家一个。此外吸收企业和科研单位通讯员、观察员。会员组成特点：保持与政府部门相对独立；企业界专家参与协作或研究、讨论。4.CIPAC方法的提出与验证程序CIPAC方法的提出与验证程序一般包括以下几个步骤，即：（1）组织者提出建立有关分析方法的任务，CIPAC将任务指派给某区域的PAC。（2）组织者将详细分析方法和资料交PAC，确定试验方案。（3）少数实验室进行小规模试验，由组织者评估其作为进一步协作研究的可能问题。（4）交CIPAC讨论是否作为国际间协作，必要时对数据进行更细致查看。（5）CIPAC秘书处确定协作实验室和分发样品、资料。（6）国际协作结果交PAC讨论，通过后交CIPAC。（7）方法连同实验数据公布；方法通过或修订。5.CIPAC手册颁布的分析方法CIPAC手册颁布的分析方法有以下几种类型：CIPAC方法（F）：为获得全体成员国可以接受结果的方法；CIPAC暂定方法（P）：候选的CIPAC方法，预期经过阶段性试验可以成为CIPAC方法，或者是具有昀小缺陷的然而却是目前所能获得的昀好方法。CIPAC暂行方法（T）：由于技术上或其它原因尚不能在整个国际范围内进行协作研究然而却满足了某些特殊需要的方法。此外，CIPAC手册中涉及的一些非正式出版发布的方法或者方法的某个部分可以通过CIPAC秘书处索取。6.CIPAC发展展望：CIPAC鼓励组织者在通用的体系上建立标准、CIPAC方法反映分析技术的进展、CIPAC鼓励建立仪器分析方法，对物理化学性质作更客观测试。(二)CIPAC关于农药原药与制剂分析方法的准则与指南进行产品的化学分析选取分析方法必须遵守三个基本原则，即：采用标准分析方法；可以自行开发并验证用于质量控制的分析方法、使用实验室熟练掌握的且经常使用的分析方法。1.有关定义•（l）误差：本准则中确认的误差类型有：①偶然误差：此类误差通常微小，由偶然误差导致的结果，多数接近于平均值范围，换句话说，由它们决定方法的重复性或再现性。②系统误差：此类误差使所得结果偏离，其平均值高于或低于实际值（如方法中某些误差可导致不正确结果）。(2）精密度：精密度是偶然误差的基度，可用重复性和再现性表示，此类术语在ISO5725中均有说明。①重复性指采用相同方法，在同一实验室用同一试验物质，同一操作者使用同一设备，在短时间间隔内，在相互独立试验中所获得结果的一致性。②再现性指采用相同方法，在不同实验室用同一试验物质，由不同操作者使用不同设备所得试验结果的一致性。（3）准确度：方法的准确度指所得结果与分析样品中真值的符合程度。（4）线性范围：试验方法的线性范围指在一定范围内所得试验结果与分析样品浓度（剂量）成比例的性能。（5）特异性：方法特异性定义为对所分析的特定样品产生的特定信号。2.单个实验室内部的误差来源：主要包括以下因素，即每个分析测试员之间的差异,仪器之间的差异,实验试剂与消耗品之间的差异,一定时间内以上因素引起的差异。3.方法确证（methodvalidation）的内容方法确证应该包括以下基本内容：（1）在方法中被分析物质（和内标物，如适宜）响应的线性。（2）分析方法精密度的评价。（3）分析方法准确度的证明。（4）赋形剂中无干扰物的证明。（5）被测定物质种类的确定。线性范围的考察：分析物质响应的线性范围，至少应大于分析物标明浓度的±20％。至少测定3个浓度，每个浓度测定两次，应附上此线性图、斜率、截距和相关系数等数据。测得的斜率可证明响应与分析物浓度之间有明显的相关性。在标明值±20％范围内，其结果不应与线性有显著偏离，即相关系数（y）应＞0.99，否则提交方法必须同时提供如何保持本方法有效性的说明，如故意使用不成线性响应的方法，也必须提出解释。精密度考察：•①化学分析：在此类准则中要求对重复性简单评价即可。至少作5次重复样品的测定，同时简单评价其结果，包括相对标准偏差RSD％。如认为合适，对测定中偏离数据可用Dixons或Crubbs试验检验，但要舍去某些结果时，必须明确指出，并应设法解释为何产生偏离的数据。•数据结果的合格性应以修改的Horwitz公式为依据：•RSDy＜2（1－0.51ogC）X0.67•式中C为样品中分析物浓度，以小数计。Horwitz公司的推导和使用实例列于（附件1）中。②物理化学性能测定：当进行物理或物理化学性能测定时，使用官方方法（如CIPAC或OECD）即不需要再予确认。本原则亦适用于对此类方法略有改动的情况，如使用其他方法时，必须测定其重复性，但无须遵守Horwitz公式。方法的准确度评价：评价方法的准确度，至少需要4个已知含量的实验室样本进行测定，其结果可用studentst统计或附件Ⅱ中其他适用方法检验。非分析物质的干扰证明：在评价准确度时，通常包含非分析物质的干扰，因赋形剂中的任何干扰物均会导致分析方法出现系统误差。然而分析时应同时测定不带赋形剂的空白样品，或证明其无干扰，如有干扰时可测定数量，样品色谱图和其他结果均应附上。当原药有效成份中有特定杂质时，必须证明在相同分析条件下此类杂质的响应值不应大于被分析物或内标总峰高的0.3％。如有此类偏离，必须在提交报告中说明其数据是否已经校正。方法的特异性：方法特异性应以被分析物质的特点来确定，通常对此类化合物进行质谱测定，如使用GC／MS，LC／MS的二极管陈列检测器或峰收集后使用质谱测定。在使用色谱法测定时，通常以此作为鉴别有效成份或确认分析标准品的方法。当制剂分析是根据其中一种方法时，不需要重复此项工作。对创新的色谱法，必须确定其特异性，如使用质谱法，则可由质谱图来推断。实际测定时被测定物质的种类应在提交登记资料时阐明，否则必须解释其理由。对多种制剂适用性的确认：对多种制剂适用性的确认数据：确认数据一般为针对某一特定的制剂，但制造商可能生产许多类似的制剂，并可能使用同一分析方法，其交互使用规则为：①制剂中应含有相同（或很类似）助剂，改变助剂性质时，应检验可能的干扰。②制剂在物理化学性能上不应有显著区别（如P”值）。③在测定溶液中，有效成份浓度必须保持在标明的线性范围内。④有关助剂浓度的任何变化，不应产生明显干扰。提交进行交互使用的方法，应考虑以上几点。（5）提出确认的任何方法，只能使用经过认证过的参比物质（或来源于参比物质）作为标准品，本要求不适用于内标物。4.重复性可行性的Horwitz公式•适用于本文的下述实例浓度范围是0.25％～100％。••％RSDR＝2（1－0.51ogc）••式中％RSDR是实验室间的变异系数（CV），C是样品中被分析物的浓度，以小数计。••因此100％的纯样品，则C＝1，logC＝0，•故％RSDR＝2（1－（0.5X0））＝2；•50％的样品（如500克／千克可湿性粉剂），则C＝0.5，logC＝-0.3010，故％RSDR＝2（1一0.5X（一0.3010））＝2.22；•其它数值为：对20％的样品，％RSDR＝2.55；•10％，％RSDR＝2.83；•5％，％RSDR＝3.14；•2％，％RSDR＝3.60；•l％，％RSDR＝4.00；•0.25％，％RSDR＝4.93。•Horwitz注意到RSD（重复性变异系数）通常为RSDR的1／2和2／3之间，为此重复性的变异系数即Horwitz的值为RSDRX0.67。根据以上数值，可得出如下结果：•被分析物％HorwitzRSDR建议的RSDY10021.34502.221.49202.551.71102.831.953.142.123.62.41142.680.254.933.3•未经修改的Howrwitz上式是CIPAC协作研究试验方法可行性的依据。•1.3.4下列阐明评价方法准确度的各种途径：(1）一种方法的准确度，可以从测定已知分析物含量的大量“样品”的结果获得。这些样品由实验室制备，加入已知量的分析物（其数量根据方法要求）并带有助剂的混合物。加入的被分析物必须是已知有效成份含量的原药。在分析样品过程中应消除取样误差，并严格按照提出的方法，至少测定4个回收率，测得的数据可用下列办法处理：•①计算回收率平均值和回收率的相对标准偏差。②对这些结果和评价重复性的结果进行F检验，以确定回收率结果的RSD与评价精密度结果之间无显著差异。③如能达到②项对回收率结果可用Studentt检验，其目的是为证明获得回收率（平均值）与加入浓度之间差异仅仅是由于偶然误差（无明显的系统误差）。|T|＝|（ω－μ）n／S|X＝样品平均值，μ＝真值，n＝样品数量，S＝标准偏差。t在不同自由度（n－1）的临界值在一般的统计表中列出。如果算得的t值未超过临界值。证明在给定的置信区间（95％即可）没有显著系统误差。（2）上述表达式可再整理为平均数的置信区间，可定为一个范围，样品的真值是在此范围内（在给定的置信度）μ＝X±t（∫s/n）自配的制剂平均回收率的计算如下：平均回收率（％）＝测定含量的平均值％X100／理论含量％平均回收率应在以下的范围内：有效成份标明值％平均回收率％＞1098.0～102.01～1097.0～103.0＜195.0～105.0•（3）对上述两种情况，本消除取样误差必须分析一种完全自配制剂。相同步骤也可用于已知成份混合物的子样品分析，但必须注意，在取样时如制剂样品不均匀，则将使平均数的置信区间数值人为增大。•（4）当分析样品很难获得重复结果的制剂（如颗粒或块状饵料），可通过添加标准品的方法来计算准确度。在这种情况下，必须提交如何添加标准品的细节报告。1.4方法验证的程序方法验证可以分为4个阶段：验证前期预备（Pre-validation）、验证各指标（Validation）、研究其性能（PerformanceCheck）、统计分析（StatisticalAnalysis）。但方法验证不是一个简单的过程，它可以是一个持续的、通过验证分析方法不断提高分析的可靠性的手段；因此一个阶段性的分析方法验证的完成可意味着一个改善的新的验证过程的开始。方法验证的重要性：确定方法的应用范围与局限性、由质量控制样本确定结果的可接受范围、验证分析测定是否真实可靠。农药分析方法验证的基本内容包括：准确性Accuracy:与真值的偏离程度线性范围Linearity:分析的可靠范围（定量分析的基础）精确性Precision:结果之间的接近程度灵敏度Sensitivity:不同浓度样本的响应大小特异性Specificity:分析物定性的考察添加回收率Recovery:测定样本中分析物全部的能力重现性Reproducibility稳定性Stability分析方法各步骤中分析物稳定性抗干扰能力Robustness分析范围AnalyticalRange农药分析方法验证的基本手段：不同分析人员在不同天对同一样本或方法进行至少4次测定添加可能干扰样本分离的类似物以确立色谱分离方法并保证分析的特异性通过添加标准品确定回收率水平添加稳定性分析物测试分析流程重样本制备与储存的稳定性标准校正曲线昀好3－5浓度水平(level)，每个点7个重复（6个自由度），需要考察相关系数（0.997）、以及斜率Slope的可