鱼饲料检测方法

HPLC检测饲料中孔雀石绿的方法孔雀石绿（malachitegreen）又称为苯胺绿、维多利亚绿或中国(China)绿，是一种具有金属光泽的绿色晶体。孔雀石绿的化学官能团三苯沼气(CH4)是一种致癌物资，且其易在鱼体内和情况中残留，存在致突变、致畸和致癌的危险，故我国、美国(UnitedStates)、加拿大(Canada)以及欧盟等很多国度均制止其在经济鱼类（观赏鱼除外）和人类食用鱼中应用。鱼粉是饲猜中动物卵白的重要起源，含有孔雀石绿及其代谢物的鱼粉添加到饲猜中可经由进程食品链要挟到人类健康。我所现采用NY/T1756-2009标准，应用高效液相色谱法（HPLC）对饲料中孔雀石绿进行测定，本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为10μg/kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为1.0μg/kg。现将该方法简要介绍如下：1.原理以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。2.分析步骤2.1提取称取饲料样品约5g(精确到0.001g)，置于100ml离心管中，依次加入1.5ml盐酸羟胺溶液、2ml对甲苯磺酸溶液、5ml乙酸钠缓冲溶液和20ml乙腈，加入约2g酸性氧化铝，振荡2min，超声30min，4000r/min离心5min。将上清液转移至250ml分液漏斗中，向离心管中再次加入20ml乙腈，振摇2min，4000r/min离心5min，合并上清液至分液漏斗中。2.2液液萃取加入50ml氯化钠溶液、50ml二氯甲烷，旋摇，静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入20ml二氯甲烷，旋摇，静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5ml，乙腈溶解残渣，备用。2.3净化2.3.1固相萃取柱的活化按中性氧化铝柱在上、PRS柱在下的顺序将两柱串联，使用前用5ml乙腈预洗两柱。2.3.2上样将2.3.1的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内,在抽真空情况下过柱(保持流速1ml／min)。再用5ml乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5ml乙腈洗涤小柱。2.3.3洗脱收集弃去中性氧化铝柱，用乙腈-乙酸钠缓冲溶液2ml、盐酸羟胺甲醇溶液lml洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径0.45μm)，上机测定。2.4样品测定2.4.1色谱条件色谱柱：氰基柱，250mm×4.6mm，柱后氧化铅柱：35mm×4.6mm。流动相：乙腈＋乙酸钠缓冲溶液＝60＋40(v＋v)；流速：1.0ml/min。柱温：室温。进样量：50μl。检测波长：600nm。2.4.2定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液及试样溶液，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。1氯霉素类药物概述氯霉素类药物是应用广泛的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗中，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。氯霉素最初是从委内瑞拉链丝菌的培养液中提取制得，现在基本使用化学合成法大量生产。其性质稳定，在干燥状态下可保存药效达2年以上，易溶于有机溶剂，25℃时100ml水中仅溶解25mg。水溶液呈中性，在酸性和中性溶液中较稳定，遇碱类易分解失效。其合成品具有左旋光性，也称左霉素。2氯霉素残留对人类健康的危害2.1骨髓造血机能紊乱氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血性等，多数在长期或多次用药的过程中发生。2.2对早产儿和新生儿的毒性在早产儿和新生儿肝内有些酶系统发育尚不完全，葡萄糖醛酸结合的能力较差，因此影响氯霉素在肝中的解毒作用；此外，肾脏排泄能力亦较弱，能招致药物蓄积中毒。2.3胃肠道症状、口部症状胃肠道反应主要有腹胀、腹泻、食欲减退，恶心、呕吐则少见。口部症状如口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。2.4其它不良反应可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生中毒性精神病，主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。3氯霉素残留对我国动物产品出口的影响氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。几年来，我国出口到欧盟、美国等地区的水产品、蜂蜜等多次因为氯霉素超标被限制，损失达到数十亿美元。4氯霉素残留检测方法近年来各种关于氯霉素残留的检测方法不断涌现，大致可分为三大类：第一类是生物测定法，第二类是理化分析法，第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。4.1筛选检验方法在实际工作中，不可能也没必要对所有动物性水产品进行各种复杂、昂贵且耗时的分析检测。为能快速确定动物食品中是否有氯霉素残留，通常做法是遵循一定程序，对被测产品进行取样，按规范要求对样品进行筛选检验，对筛选为阳性的样品再用更精确的方法进行定量鉴定。4.1.1微生物法在快速筛选检验程序中，微生物法非常有效，这类方法简单、费用少、速度快，因而广泛用于动物性食品兽药残留的初筛。4.1.1.1棉签法棉签法又称现场拭子法，是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。该方法是用棉签（拭子）采取动物体内的组织液，然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。观察是否在拭子周围出现抑菌环，若有，即表明组织液中有抗生素存在。如果该动物仅用氯霉素进行过治疗，则可以认为该组织中存在氯霉素残留。此方法在几分钟内即可完成取样操作，16～18h即可获得结果，是简便易行而又有一定准确性的检测方法，比较适合基层现场筛选检测。但是该检测法灵敏度较差，检出限较高，多在μg/g级，特异性差，一般抗生素类药物都有此类反应，而且不能定量。4.1.1.2杯碟法样品经处理后，注入牛津杯中，与含菌液的检定平板贴合，培养后，根据抑菌圈有无及大小判定结果。采用不同的试验菌种，可检测不同的抗生素。此法检出限为0.25μg/g。这种方法与棉签法相比，灵敏度高，能够排除一定的干扰，但要进一步提高灵敏度很困难。4.1.2免疫分析方法免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。免疫反应具有很高的选择性和灵敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。作为相对独立的检测方法，即基于竞争结合分析原理的免疫测定法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、固相免疫传感器等。目前使用最普遍的酶联免疫法（ELISA），具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。ELISA是基于抗原和抗体反应而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激机体产生抗体。要使半抗原性物质具有免疫原性,就需使其与大分子载体物质(蛋白质)相结合制备人工抗原,而后将其作为抗原进行使用,动物体内即可产生相应特异性的抗氯霉素的抗体,在此基础上建立酶联免疫竞争法测定氯霉素含量。此种方法灵敏度高，检测下限可达0.05μg/kg，重现性好，回收率高，在1μg/kg的添加水平下，回收率可达107%～113%。酶联免疫法的缺点在于影响因素较多,易出现大量假阳性结果;抗体批次不同,测定结果也会出现差异。4.2定量确认方法4.2.1高效液相色谱法高效液相色谱法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定，但检出限较高，为5～10μg/kg，回收率偏低。因为动物体内成分复杂，一些杂质干扰测定，应用该法检测时，对于样品预处理必须仔细谨慎，以提高测定准确性和灵敏度。4.2.2气相色谱法目前较常用的氯霉素确证方法是气相色谱法,该方法的特点是高分离效能、高选择性、高灵敏度、检出限低、快速、应用广,还可用于制备高纯物质。它可以对于分配系数相差很近的组分进行分离,从而分离出极为复杂的混合物。检出限一般为μg/kg级,常用于抗生素药物残留的检测。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步聚,因而限制了气相色谱法的应用。饲料中氯霉素含量的检测目前采用气相色谱法。该方法先将配合饲料用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮气吹去乙酸乙酯后，残渣用甲醇/氯化钠溶液溶解，用正己烷液－液萃取除去油脂及脂溶物，氯霉素再用乙酸乙酯提取、吹干，C18小柱净化，经衍生剂衍生后用配有电子捕获检测器的气相色谱检测。气相色谱条件如下。载气：氮气1.5ml/min；补充气：氮气25ml/min；分流比：1：10。温度：气化室280℃；检测器300℃；柱箱230℃。在上述仪器条件下，注入标准工作液1μl，调整试样定容体积使试样溶液中氯霉素的峰值与标准工作液中氯霉素峰值相近，以保留时间和峰值的比较对氯霉素进行定量计算。重复性：两个平行测定的结果相对偏差不得大于5％。回收率：添加量在0.01mg/kg时，回收率在90%~105%。该方法的最低检出限为0.005mg/kg。5结论总的来说，基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短。近几年酶联免疫法得到了很大的发展,假阳性率明显降低,而且适应广泛。目前在肉类、鱼虾、蛋品、尿液、血清、牛奶、蜂蜜及饲料中都用酶联免疫法来做氯霉素检测的筛选。国际上公认的定量确认方法仍是理化分析法，主要是气相色谱法和液相色谱法，这两种方法灵敏度高，结果准确，重复性好，假阳性少，缺点是样品前处理过程复杂、仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢。二者相比较，由于HPLC检出限较高，已逐渐不能满足发达国家对检测方法检出限的要求。联用技术出现后，LC-MS由于灵敏度高,检出限更低,结果精确可靠,在氯霉素残留的分析中正逐渐代替单一的色谱技术。饲料中铅的测定方法GB13080—1991A.1主题内容与适用范围本标准规定了饲料中铅的测定。本标准适用于饲料原料（磷酸盐、石粉、鱼粉等）、配合饲料（包括混合饲料）中铅的测定。A.2原理样品经消解处理后，再经萃取分离，然后导入原子吸收分光光度计中，原子化后测量其在283.3nm处的吸光度，与标准系列比较定量。A.3试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为去离子重蒸馏水或相应纯度的水。A.3.1硝酸，优级纯。A.3.2硫酸，优级纯。A.3.3高氯酸，优级纯。A.3.4盐酸，优级纯。A.3.5甲基异丁酮[CH3COCH2CH（CH3）2，HG3－1118]。A.3.66mol/L硝酸溶液：量取38mL硝酸，加水至100mL。A.3.71mol/L碘化钾溶液：称取166g碘化钾（KI，GB1272），溶于1000mL水中，储存于棕色瓶中。A.3.81mol/L盐酸：量取84mL盐酸，加水至1000mL。A.3.95%抗坏血酸溶液：称取5.0g抗坏血酸（C6H8O6），溶于水中，稀释至100mL，储存于棕色瓶中。A.3.10铅标准储备液：精确称取0.1598g硝酸铅（HG3—1070），加6mol/L硝酸10mL，全部溶解后，转入1000mL容量瓶中，加水至刻度，该溶液为每毫升0.1mg铅。A.3.11铅标准工作液：精确吸取1mL铅标准储备液，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液为每毫升1μg铅。A.4仪器、设备A.4.1消化设备：两平行样所在位置的温度差小于或等于5℃。A.4.2马福炉。A.4.3分析天平；感量0.0001g。A.4.4实验室用样品粉碎机。A.4.5振荡器。A.4.6原子吸收分光光度计。A.4.7容量瓶：25、50、100、1000mL。A.4.8吸液管：1、2、5、10、15mL。A.4.9消化管。A.4.10瓷坩埚。A.5试样制备采集具有代表性的饲料样品，至少2kg，四分法缩分至250g，磨碎，过1mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，低温保存备用。A.6测定步骤A.6.1试样处理A.6