土壤PLFA--测定方法

土壤PLFA测定方法一、原理：Phospholipidfattyacids(PLFAs)areexclusivelypresentinthemembranesofalllivingcells.ThePLFAprofileofthesoilmicrobialcommunityreflectsbothspeciescompositionandrelativespeciesabundance.Phospholipidsdecomposerapidlyoncelldeath(byhydrolysisofthephosphategroupbycellularenzymes)thereforeitisassuredthatonlythelivingcellsarestudied.PLFAprofilesaredeterminedusingamodificationofthemethoddescribedbyFrostegardetal(1991),asbasedonthemethoddescribedbyBlighandDyer(1952)andWhiteetal(1979).N.B.（注意事项）Avoidexcessiveexposuretolightthroughoutthismethod,especiallyfromfluorescentlights,aslightdegradesphospholipids.(易被光解，故后续操作用锡纸包裹)Glasswareshouldbeionandorganicfree.Dirtyglasswareshouldbeimmersedinhotwaterwithphosphatedetergent(Decon)andrinseddeionisedwater.Thedryglasswarecanthenbeeitherwrappedinaluminumfoilandheatedat450ºCfor4hrsoralternativelyrinsedinmethanolthenchloroformanddried.Alternativelyusenewsterileglassmediabottlesthroughout.Theneedlesofthesampleconcentratorshouldbewashedinmethanolbeforeuse.(氮吹仪针头，用前用正己烷擦拭)FattyAcidMethyylEsters(FAMEs)canbequantifiedbyusingnonadecanoicacidasaninternalstandard（定量用内标）.AFAMEstandardsuppliedbySupelcoisusedforqualityassuranceoftheGCrun.附表：试验用药品、仪器清单。准备——FirstStage(0.5day)二、提取1、试剂0.15mol/L柠檬酸缓冲液：31.52g柠檬酸溶解于1L去离子水中，用NaOH调pH到4.0；Bligh-Dyer土壤提取液：氯仿：甲醇：柠檬酸缓冲液=1：2：0.8(体积比),Add0.005%w/v(50mgl-1)butylatedhydroxytoluene(丁基羟基甲苯)asananti-oxidant，使保存时间增长。2、具体步骤取5.0-10.0g鲜土，冷冻干燥后置于50ml特氟龙管中；加入15mlBligh-Dyer土壤提取液；超声30分钟，振荡30分钟（180rpm），离心（3800rpm）10分钟；用Pasteurpipette或倾倒法将上清液转移至50ml干净的玻璃管中（试管需提前用锡纸包好）；再取10mlBligh-Dyer土壤提取液于特氟龙管中，超声20分钟，振荡10分钟，3800rpm离心10分钟，用Pasteurpipette或倾倒法将上清液转移至试管中（两次上清液混合）；在上清液混合的试管中加4ml柠檬酸缓冲液和4ml氯仿，涡旋振荡至溶液呈白色浑浊状（约10秒）；锡纸封口4℃冰箱中静置过夜；——SecondStage(0.5day)用长滴管吸出下层液体至10mL螺口管中，用氮气吹干（inawaterbathsetat37ºCtopreventthebreakdownofunsaturatedfattyacids.Whendryingthesamplesundernitrogenavoidcrosscontamination（交叉污染）ofsamplesbykeepingtheneedlesclean）；-20℃冰箱保存待过柱。三、过柱纯化1、硅胶柱准备在硅胶柱上加入0.5g无水硫酸钠；先后用2ml甲醇、丙酮和氯仿润洗硅胶柱，稍微静置待洗液完全滤干；加入2ml氯仿，并且让氯仿流下（从此处开始要注意不能让硅胶柱干）。2、具体步骤加入1ml氯仿至螺口管中重新溶解氮吹后的样品（注意使壁上的残留也完全溶于氯仿，若出现絮状不溶物，则需加入0.5ml甲醇，用氮吹干后继续上步，直至加入无不溶物出现）；将溶解后的样品用长滴管加到硅胶柱中；加入4ml氯仿（2ml×2次）将中性脂质洗脱（先加入螺口管，继而转移至硅胶柱）；用12ml丙酮（2ml×6次）将糖脂洗脱（先加入螺口管，继而转移至硅胶柱）；换干净的螺口管，以接受产物；加入8ml甲醇（2ml×4次）将磷脂洗脱；37℃水浴氮吹去有机溶剂，加入内标溶液200μl，再次氮吹干燥；产物置于-20℃冷冻保存。四、甲基化1、试剂试剂a：体积比1:1的甲苯（分析纯）和甲醇（色谱纯）。Thismixmustbekeptmoisturefreebystoringonsodiumsulphate（加少许无水硫酸钠）试剂b:0.2M的KOH,0.56gKOH溶于50ml色谱纯的甲醇中。Thismustbemoisturefreeandsoispreparedonthedayofuse.Potassiumhydroxideishygroscopic,andshouldthereforebekeptoutofairtopreventwaterabsorption（当天配用）试剂c:1M醋酸溶液（59ml冰醋酸用水定容至1L）试剂d:正己烷:氯仿体积比4:1(色谱纯)2、具体步骤加入1ml试剂a将样品溶解；加入1ml试剂b将脂肪水解；涡旋混匀后置于37℃培养30min；加入0.25ml试剂c用以调节pH和终止反应；加入5ml试剂d，混匀后再加入3ml去离子水（washedwithchloroformifnecessary）；超声30min，冷藏（4℃）过夜或——ThirdStage(0.75day)五、清洗1、试剂0.3MNaOH2、具体步骤静置过夜后，使用Pasteurpipette吸取上清液于干净螺口管中；加入3ml0.3MNaOH溶液，混匀后静置片刻待其分层；用Pasteurpipette吸取上层液到干净螺口管中；20-25℃条件下用氮将其吹干；Storethedriedfattyacidmethylesters(FAMEs)inafreezerat-20ºCundernitrogen。——FourthStage(0.25day)六、上机用2×100μL的正己烷（色谱纯，HPLC）溶解螺口管中的待测样品，转移到内插管中，测定。注意事项：安全：需穿带实验服、手套；所有操作均在通风橱中进行。溶剂：氯仿，甲醇，丙酮，60ug/mL的内标样十九烷酸nonadecanoicacid(C19:0,溶于甲醇)C19:0InternalStandard:weighaccuratelyto5decimalplaces,approximately6mgofNonadecanoicacidMethylEster(C20H40O2)anddissolvein250mlmethanol(storeincoldroomat3-5oC).Theweightusedmustberecorded（6monthsexpiry）；器皿：所有玻璃仪器用前都要用酸水浸泡、纯水冲洗和烘干，未烘干时需用正己烷清洗并吹干。附表：试验用药品、仪器清单（8个样品为标准）药品器皿及其数量仪器正己烷玻璃试剂瓶（1000ml）*2冷冻干燥仪柠檬酸玻璃试剂瓶（200ml）*5超声仪氢氧化钠塑料试剂瓶（500ml）*1摇床氯仿特氟龙管*8离心机甲醇专用玻璃管*8冰箱丁基羟基甲苯巴斯德管胶头*8涡旋仪锡纸巴斯德管*8+8+8+8+8氮吹仪氮气移液管（20ml）*1水浴锅无水硫酸钠专用加液枪*1真空泵丙酮枪头*2+2+5+1（细型）恒温培养设备内标样螺口管*8+8+8+8（短）+8（短，装废液用）通风橱甲苯硅胶柱架*1氢氧化钾硅胶柱*8冰醋酸硅胶柱接头*8硅胶柱针头*8GC管和盖子*8内插管*8样品瓶架备注备注备注试剂药品尽量使用优级纯级别