第五章 多倍体育种

第五章多倍体育种Chapter5PloyploidBreeding鱼类多倍体与多倍体育种多倍体：体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。多倍体在高等植物中是相当普遍的，例如显花植物中大约有一千种以上是多倍体，栽培植物中更为常见，禾本植物可达75%。但动物界中的多倍体却少得多，脊椎动物则更少。但在鱼类，多倍体比较普遍，如鲑科、胭脂鱼科、银鲫、花鳉科等。多倍体育种：通过增加染色体组的方法来改造生物的遗传基础，从而培育出符合人们需要的优良品种，达到人类利用的目的。属细胞工程中的染色体组工程。多倍体的种类根据产生方法，分为天然多倍体和人工多倍体；根据染色体组来源，分为同源多倍体和异源多倍体；根据染色体组数目，分为三倍体、四倍体、六倍体、八倍体等。同源多倍体和异源多倍体同源多倍体：由相同来源染色体组形成的多倍体，即同源多倍体的染色体组来自同一物种。染色体已经复制，而细胞质不分裂。异源多倍体：由不同来源染色体组形成的多倍体，即异源染色体的染色体组来自不同物种。两个不同的物种杂交，它们的杂种再经过染色体加倍形成异源多倍体。多倍体产生的机制多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，染色体加倍则通过卵子第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现。鱼类精子入卵在第二次成熟分裂的中期，受精后放出第二极体。卵子受精后因受各种理化因子刺激而不排出第二极体，即没有经过减数分裂而形成二倍体卵核，然后与单倍体精核结合形成三倍体受精卵。受精卵的第一次有丝分裂受到抑制，则产生四倍体。授精不育三倍体温度休克，静水压处理授精鱼类卵子精子受精卵（正常二倍体）抑制第二极体排出抑制第一次卵裂四倍体鱼类三倍体研制技术路线国外鱼类多倍体研究概况人工诱导鱼类多倍体，最早记载(1943)日本将鲤鱼受精卵低温处理，产生二倍体卵核。1945，冷水处理白鲑受精卵、大西洋鲑与褐鳟杂种卵，得到三倍体囊胚。1956-1959，低温诱导三棘刺鱼获得三倍体，且饲养至性成熟，真正诱导成功鱼类三倍体。1972，人工诱导鲽与川鲽杂种三倍体获得成功。先后已在三棘刺鱼、鲽、川鲽、大菱鲆、菱鲆、鲤鱼、奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、虹鳟、大西洋鲑、泥鳅、美洲红点鲑、斑点叉尾鯝、草鱼和鳙等30多种鱼类成功诱导多倍体，有的应用于生产，产生明显经济效益。国内鱼类多倍体研究概况我国鱼类多倍体育种研究起始于20世纪70年代中期，水生所1976、1979首次报道理化方法诱导草鱼♀×团头鲂♂杂种及草鱼三倍体和四倍体获得成功。接着，在鲤鱼、鲢、虹鳟、鳙、水晶彩鲫和白鲫等近20种淡水鱼类获得三倍体和四倍体试验鱼。海水鱼类只有牙鲆、黑鲷和真鲷等。我国鱼类多倍体研究进展较快，进入实用性阶段。诱导多倍体鱼类的方法生物学方法：远缘杂交、核移植、细胞融合；物理学方法：温度处理、静水压处理、电休克化学方法：细胞松弛素B、秋水仙素、聚乙二醇、6-二甲基氨基嘌呤。生物学方法1、远缘杂交鲤科鱼不同亚科间的杂交往往可产生多倍体。1978年发现草鱼♀×鳙♂的杂种是三倍体，1982年又发现其杂种同时出现二倍体和三倍体。1981年兴国红鲤♀×草鱼♂获得异源四倍体杂种，1987年草鱼♀×三角鲂♂是异源三倍体。全雌雌核发育二倍体花鳉与黑花鳉雄鱼受精获得不育三倍体杂种。生物学方法2、核移植用四倍化的草鱼培养细胞作供体移植到泥鳅去核卵内，获得到心跳期的四倍体胚胎。可能是诱导四倍体的有效途径。3、细胞融合诱导鱼类囊胚细胞之间、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或受精卵之间细胞融合，理论上应该产生三倍体或四倍体，但由于染色体重排，得到各种不同数量染色体的细胞群。如草鱼囊胚细胞与团头鲂受精卵的电融合，98个卵中，73个发育到原肠胚，65个到心跳期，49个到仔鱼。染色体数目56-88，为嵌合体。用来研究外源染色体对发育的影响，探讨改良品种的可能性。物理学方法1、温度处理(温度休克)包括热休克和冷休克。温度处理必须确定处理的开始时间、持续时间及温度高低。温度休克的敏感性差异与遗传背景和卵子成熟度有关。为了加强刺激强度，冷水性鱼类(如鲑科鱼)宜用热休克，温度范围28-36；温水性鱼类(如鲤科鱼)宜用冷休克，温度范围0度左右，不能超过致死温度。温度处理简便，无需专门设备，效果较好。物理学方法2、静水压处理需用专门的水压机，处理的最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，对胚胎的损伤小于温度休克，是鱼类染色体操作的有效方法。最初用静水压与乙醚结合产生二倍体雌核发育斑马鱼，上水大用于诱导三倍体虹鳟，水生所用静水压处理获得批量三倍体和少数四倍体水晶彩鲫，日本用静水压处理成功诱导出批量四倍体牙鲆。物理学方法3、电休克用热休克与电休克相结合诱导银大麻哈鱼三倍体获得成功。将受精后40分钟的卵置于26度，并给以10分钟交流电休克。化学方法用过的化学物：细胞松弛素B、秋水仙素、聚乙二醇、4,6-二甲基氨基嘌呤。细胞松弛素B用于诱导贝类多倍体，秋水仙素用于诱导植物多倍体，聚乙二醇在虹鳟等鱼类用过，目前多用4,6-二甲基氨基嘌呤诱导贝类多倍体。诱导鱼类多倍体常用温度休克和静水压，方法简便，效果较好。鉴定多倍体鱼类的方法处理多倍体不是百分之百成功，处理过的群体可能是多倍体、二倍体或嵌合体等混合组成，需要准确又简便的鉴定方法。间接方法：核体积测量蛋白质电泳生化分析形态学检查直接方法：染色体计数DNA含量测定核体积测量细胞核大小与染色体数目成正比，组成多倍体的细胞比二倍体大。红细胞的测量被用来鉴定多倍体鱼，常用核体积比，也用核面积或长、短轴之比表示。鱼类红细胞是椭圆形，二倍体与三倍体核体积比例应该是1:1.5，核面积预期比率应该是1:1.3，实测值大致符合预期比率。据测定，二倍体与四倍体面积比1:1.74，体积比1:1.91、2.00、2.05、2.42。测量方法简便，不能准确反映染色体倍性，最好用直接倍性测定法校正。蛋白质电泳蛋白质电泳鉴定多倍体鱼。实验结果：用血清蛋白电泳图谱辨别二倍体与三倍体亚马逊花鳉；关东系银鲫在血清蛋白上无明显差异，用各种蛋白质和酶电泳分析，找出肌肉肌浆蛋白和肌酸激酶是鉴别二倍体与三倍体的标记；电泳筛选多倍体草鱼与鳙鱼杂种；二倍体与三倍体关东系银鲫肌浆蛋白电泳发现不同谱带；三倍体与二倍体鲢的多种同工酶表型无区别；根据PGI-3谱带区分褐鳟二倍体和三倍体鱼苗。生化分析关东系银鲫二倍体与三倍体种群的肌肉与血液化学组成的生化分析结果：两者肌肉和蛋白质组成大体一致，三倍体的红细胞数量较少、平均红细胞体积、血红蛋白较高，三倍体红细胞的丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶活性高于二倍体。草鱼与鳙鱼杂种、大西洋鲑三倍体与二倍体血液学分析结果大致同上。二倍体与三倍体鲤鱼红细胞性状指标有差异，生化指标无明显差异。形态学检查三倍体与二倍体鱼类在形态上并无明显差别。某些情况下，因双亲基因剂量差别，较易区分三倍体和二倍体杂种。三倍体三棘刺鱼与二倍体比，躯干较短、尾部较长；仔鱼色素细胞多寡区分三倍体和二倍体鲽与川鲽杂种；二倍体和三倍体草鱼与鳙鱼杂种的26个形态与数量性状，12个可鉴别，可靠程度97%；草鱼38个性状，有8个二、三倍体存在明显差异，但单个性状不能判别；侧线上、下鳞数目区分二、三倍体白鲫。尚不能凭一两个性状简单而又准确鉴别多倍体鱼类。染色体计数鉴定鱼类多倍体最准确的方法，必须有好的染色体标本。制备染色体标本主要是细胞培养法，包括血液培养、肾细胞培养、鳞片培养、鳞培养及胚胎培养等。得到良好的染色体标本后，选择染色体数目完整、收缩适中和形态清晰的中期分裂相显微照相并放大，将照片上的染色体配对，绘制染色体组型图。花鱼骨染色体中期分裂相花鱼骨染色体核型M:中部着丝粒染色体；sm:亚中部着丝粒染色体；st:亚端部着丝粒染色体；t:端部着丝粒染色体2n=50。核型公式为20m+12sm+10st+8t，NF=82DNA含量测定细胞核内DNA含量相当恒定，不同种类生物细胞核内DNA含量差别很大，但同一种生物不同组织细胞内的DNA含量基本相同，生殖细胞DNA含量恰好是体细胞的1/2。细胞核内的DNA与染色体数目成比例，染色体倍数增加，其DNA含量相应增加，通过细胞核内DNA含量测定准确确定染色体倍数。显微光密度测定法流式细胞计数法多倍体鱼类的生长与发育多倍体鱼类的生活力三倍体鱼类的诱导成功以及天然三倍体的存在，说明三倍体鱼类具有良好的生活力。研究发现：人工诱导的三倍体鱼类具有正常的生活力，也有的比二倍体稍差些；三倍体杂种有较强的生活力，人工诱导的三倍体导致种间杂种生活力提高。四倍体鱼类的生活力预期比三倍体差。从得到四倍体成活个体表明某些鱼类四倍体与二倍体一样具有正常的生活力；但多数认为：不适宜的处理对胚胎造成伤害，影响四倍体生存能力，不适宜的处理还会导致非整倍体或嵌合体产生。提高四倍体诱导率和存活率的关键是寻求最佳诱导条件、改进诱导方法。多倍体鱼类的生长与发育多倍体鱼类的的性别用雌性配子同型及许多情况下用雌性配子异型鱼类诱导的三倍体中，预期雌性和雄性各占一半。四倍体，预期得到相等的雌雄比例。多倍体鱼类的的性腺发育三倍体鱼类预期是不育的。四倍体并不预期必然是不育的。同源四倍体部分不育；异源四倍体的能育性往往高于同源四倍体。三倍体鱼类的最大特点是不育性，即性腺不能成熟并繁殖后代，为水产养殖生产所利用。多倍体鱼类在水产养殖上的应用1、控制过度繁殖三倍体鱼类控制种群主要是草鱼及其杂种。美国引进草鱼后不能控制其天然繁殖，毁坏环境，通过培育单性或人工诱导产生不育三倍体草鱼，放流后不能繁殖。对用于种群控制的三倍体鱼类，三倍体的高效率生产是必要的，改进三倍体诱导与检测的质量控制或培育可育的四倍体。多倍体鱼类在水产养殖上的应用2、提高生长速度目的：人工诱导生长比二倍体快的三倍体用于水产养殖生产。三倍体鱼是否比二倍体生长快，实验结果差异较大。三倍体鱼的生长潜力的表达可能与鱼的种类、受精组合及染色体组数目有关。同源多倍体与异源多倍体比较，一般异源多倍体生长较快。四倍体鱼类的生长情况尚无定论。多倍体鱼类在水产养殖上的应用3、延长鱼类寿命对于性成熟时会遭受损失的鲑鳟鱼类，不育三倍体可能比二倍体存活时间长。鲑鳟鱼产卵后死亡率高，三倍体丧失生殖机能，就不存在这种情况，可延长生长。4、改善鱼肉品质鱼的质量直接影响经济价值。三倍体鱼可食率(头小、鱼片厚度大)比二倍体高，鱼肉成分和品质高于二倍体。多倍体鱼类研究发展趋势诱导方法的进一步改进与完善鉴定多倍体鱼类的方法的进一步改进全雌三倍体鱼类的诱导三倍体的杂种化人工诱导多倍体实例ArtificialInducedPolyploid湘云鲤(鲫)湘云鲤(鲫)的育种过程红鲫(雌，二倍体)与湘江野鲤(雄，二倍体)杂交，获得湘鲫杂交种(F1，二倍体)。湘鲫F1中筛选部分可育后代，繁殖出F2。湘鲫F2存在精卵多态性。F2中二倍体精卵结合产生湘鲫F3四倍体，F3-F8均为两性可育的四倍体(异源四倍体)。F3-F8作为父本，与兴国红鲤(或其它鲤鱼，二倍体)为母本杂交获得三倍体湘云鲤；与日本白鲫(二倍体)为母本杂交，获得三倍体湘云鲫。湘云鲤(鲫)特征湘鲫F1-F8的外部形态介于母本(红鲫)和父本(湘江野鲤)之间以及它们须的变化特征，说明是杂交后代，而不是雌核发育或雄核发育后代，表明湘鲫F1-F2是异源二倍体，F3-F8是异源四倍体。扫描电镜观察湘鲫F2的精子，发现精子存在多态性，其中有单倍体、二倍体、四倍体、甚至八倍体和低于单倍体的非整数倍体精子，同样F2的卵子也存在多态现象。F2产生的卵子和精子都有相当比例的二倍体，这两种二倍体配子受精即可产生四倍体。实际上湘鲫F3到F8代，也确为四倍体，并且雌雄两性均可育。湘云鲤鲫鲤杂交四倍体亲鱼（4N=200）是由湘江野鲤（♂）与红鲫（♀）杂交得F1，F1自交得F2，F2自交后获得染色体加倍的异源四倍体鱼，1988年获得第1代，到目前已培育至第9代，能自然繁殖，遗传性