转录基本知识

第三章转录基本知识RNA的生物合成RNABiosynthesis,Transcription遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上。细胞分裂过程中，DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给子细胞。子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。一些RNA病毒能以自己的RNA为模板A为合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。RNA生物合成主要内容一，RNA基本性质1，RNA化学结构2，RNA分子结构3，RNA种类及功能二，转录的分子事件1，转录概念2，转录基本特点3，转录发生过程（原核生物真核生物差异）：（1）转录的酶与蛋白因子（2）转录启动区域：启动子（3）转录的起始，延伸及结束4，真核转录后加工三：RNA降解四：RNA转录应用1，RNA化学结构RNA/DNAStructureRNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。2RNA的分子结构RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3‘，5’磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。构。3,RNA种类及功能RNA按功能不同分为三类，即信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)及核蛋白体RNA(rRNA)。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5～8倍。RNA理化特点RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。4.显色反应：鉴别DNA和RNA+浓HClRNA------→绿色化合物DNA------→蓝紫色化合物苔黑酚二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A＝1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。紫外分光光度计A260/A280和A260/A230的含义A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液A230nm，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A260/A280和A260/A230：是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5下其比值应该在2.0或2.5，A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（transcription）。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(smallnuclearRNA和HnRNA等。转录RNADNA二，转录的分子事件1，转录概念mRNA携带了DNA的遗传信息，在蛋白质合成中作为合成蛋白质的模板起传递遗传信息的作用。tRNA的二级结构最具特色，呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一是氨基酸臂的3’末端为-CCA-OH，起特异结合氨基酸作用；二是有一个反密码环，环上有反密码子，与mRNA上的密码子反向互补，于是由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子对应的部位，因此tRNA具有携带转运氨基酸的作用。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核蛋白体，分为大小亚基，存在于粗面内质网与胞浆中。核蛋白体是蛋白质生物合成的场所。snRNA参与RNA剪辑复制和转录的区别转录是基因表达的中心环节转录是以DNA为模板合成RNA,并且只是以单股DNA为模板，因此具有不对称性；用以转录的单链DNA,称为模板链,与复制不同，转录是局部的,从启动子开始到终止子结束,为一个转录单位;转录不需要引物；转录的忠实性相对弱；转录首先得到RNA前体，然后再进行加工转变为成熟的RNA.2，转录基本特点CharactersofRNABiosynthesis转录（transcription）的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。（1）、转录的不对称性能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(templatestrand)，也称作反义链。与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(codingstrand)，也称为有意义链。模板链编码链5’5’3’3’5’5’5335模板链编码链编码链模板链转录方向转录方向模板链和编码链的相对性5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′编码链模板链mRNA5′···GCAGUACAUGUC···3′转录N······Ala·Val·His·Val······C蛋白质翻译模板链、编码链与转录及翻译的关系RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。（2）、转录的连续性RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。（3）、转录的单向性RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点。特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。（4）、有特定的起始和终止位点3，转录发生过程（1）参与转录合成的酶和蛋白因子EnzymesandProteinFactorsforRNABiosynthesis原料：NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）。模板：单链DNA。酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。其他蛋白质因子：如转录因子、终止因子等。参与RNA转录合成的物质这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase，DDRP）。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5‘→3’聚合形成RNA。RNA聚合酶（DDRP）原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即2'。亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（2'）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。原核生物的RNA聚合酶核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶36512决定哪些基因被转录150618催化功能155613结合DNA模板70263辨认起始点亚基分子量功能原核生物RNA聚合酶亚基的功能单因子RNA聚合酶T3,T7，sp6噬菌体RNA聚合酶200多个氨基酸组成的多肽特异性多噬菌体上几个启动子进行转录。体外获得单链或者双链RNA的最好的工具！简单，高效。RNA聚合酶+T7/T3/T6启动子+DNA双联模板+终止子+NTP+Mg2+H2O真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种，它们均由10~12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。真核生物的RNA聚合酶在真核生物中，转录的起始过程较为复杂，现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关。凡是与基因表达调控相关的蛋白因子统称为反式作用因子（transactingfactor）。转录因子在反式作用因子中，直接或间接参与转录起始复合体的形成的蛋白因子被称为转录因子（transcriptionalfactor,TF）。不同的RNA聚合酶存在相应的转录因子，如与RNA聚合酶Ⅱ相关的转录因子包括TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH等。真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录因子及其功能协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子(terminationfactor)。有的终止信号的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这称为通读(readthrough)，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antitermination)。原核生物中的终止因子蛋白是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。蛋白能识别转录终止信号，并与RNA紧密结合，导致RNA的释放。终止因子三：RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子（promoter)终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开转录起始需解决两个问题：1.必须准确地结合在转录模板的起始区域。2.DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。1起始：RNA聚合酶识别起始区在原核生物中，若干功能相关的结构基因常常串联在一起，由其上游的同一调控序列进行调控，这种基因的组织形式称为操纵子（operon）。1.模板与酶的辨认识别：5335结构基因调控序列RNA-polDNA分子中参与转录调控的序列统称为顺式作用元件（cis-actingelement）。原核生物转录起始时，首先由RNA聚合酶中的因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为启动子（promoter）。启动子序列通常由一些带共性的保守序列构成。利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。原理:DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解，在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。在用酶移出与蛋白质结合的DNA后，又可测出被结合处DNA的序列。足迹法确定启动子序列开始转录(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子的保守序列TTGACAAACTGT-35区RNA-pol辨认位点(recogni