7第七章_细菌的遗传分析

第七章细菌的遗传分析LivingaBacteriaworld细菌与人类生活艰难梭状芽孢杆菌第一节细菌的细胞和基因组第二节大肠杆菌的突变型及其筛选第三节细菌的接合与染色体作图第四节中断杂交与重组作图第五节F'因子与性导第六节细菌的转化与转导作图第七节细菌同源重组的机制（自学）主要以大肠杆菌为对象材料介绍细菌遗传物质的传递规律、细菌染色体作图、细菌同源重组的分子机制。本章主要内容：第一节细菌的细胞和基因组一、细菌的细胞细菌包括:真细菌（eubacteria），如大肠杆菌（Escherchiacoli）古细菌（archaebacteria），如詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannasch）多种形态存在：球菌（cocci）杆菌（bacilli）螺旋菌（sprilla）等大小：杆菌一般长1～5㎛，宽0.5～1㎛；球菌以直径大小表示，一般为0.5～1㎛；螺旋菌一般长为1～50㎛，直径为0.5～1㎛细菌结构简单：基本结构：细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；特殊结构：如荚膜和鞭毛细菌繁殖快。通常20min繁殖一代。每个细胞在较短时间内(如一夜)能裂殖到107个子细胞，成为肉眼可见的菌落。细菌的繁殖：环状双链DNA分子随着细胞伸长而采取二分分裂（binaryfission）的方式分开。细菌的遗传物质：染色体：一个环状闭合双链DNA，单倍体结构。没有组蛋白和其他蛋白质结合，不形成核小体结构。质粒(plasmid)：染色体外的一个或多个小DNA分子。二、细菌的基因组细菌染色体形成“拟核”（nucleoid），其长度为250～35000μm不等。拟核的结构：拟核最显著的特征是其DNA被包裹压缩成一个个有序的环状结构域(loopdomain)。•大肠杆菌基因组长4.7×106bp，1333μm长，是其细胞长度的1000倍，必须压缩至少1000倍后才能装入细胞中。•大肠杆菌拟核中约有100个结构域，每个相当于40kb，各个结构域具有相对的独立性。•结构域是超螺旋结构。拟核的成分：DNA占80％，其余为RNA和蛋白质。已分离出HU、H1等DNA结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构域的形成有关。拟核的中央部分为支架蛋白和RNA。用RNA酶处理，拟核中DNA的折叠结构即不能保持，说明RNA和支架蛋白是保持拟核结构的重要因素。用DNA酶处理大肠杆菌拟核中，各结构域DNA链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。E.coli基因组概况E.coliK-12MG1655菌株全基因组（1997年测序）:4639221（约4.7×106）bp。其中：87.8％编码蛋白质0.8％编码稳定性RNA0.7%无编码功能的重复序列11％属调节序列和具有其它功能总共编码4288种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约38％功能不明。基因的平均长度为950bp，基因之间的平均间隔约为118bp。2005年报道了E.coliK-12W3110菌株基因组的完整序列：K-12W3110基因组大小为4,646,332bp基因总数为4464个；K-12W3110与K-12MG1655两者相同的基因为4453个。可见不同菌株的基因组大小和基因数目有差异。作为研究材料的优越性世代周期短；易于管理和进行化学分析；研究基因作用简单；属于单倍体，所有突变立即表现出来；遗传物质较高等真核生物简单，基因的定位、结构分析及分离均易于操作。一、常见的大肠杆菌菌突变型1、合成代谢功能的突变型:又称营养缺陷型，丧失合成某种营养物质的能力。不能在基本培养基中生长。对应于缺陷型的野生型菌株称为原养型(prototroph)。例：表型Thr+——Thr-;基因型thr+——thr-2、分解代谢功能突变型：又称糖发酵突变型，丧失利用某种糖的能力，即不能发酵某种糖类。例：表型：野生型Gal＋，突变型Gal－或Gal；基因型：野生型gal＋突变型gal－或gal第二节大肠杆菌的突变型及其筛选两者多是条件致死突变型3、抗性突变型:(1)抗药突变型:对抗菌素具有抗性。链霉素抗性突变型：strr——strs(2)抗噬菌体突变型：抗噬菌体感染。抗T1噬菌体突变型：tonr——tons抗T2噬菌体突变型：Ttor——Ttos对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低。细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。如对链霉素抗性突变的细菌是由于核糖体的30S亚基的S12蛋白变异。链霉素能和敏感细菌（野生型）的S12结合，从而使翻译过程发生差错或者使翻译过程的启动作用失效。而抗链霉素突变型的S12不再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。1、细菌培养--平板培养划线法培养涂布法培养二、细菌的培养与突变型筛选2、测定突变的方法──影印法由黎德伯格等(Lederberg，1952年）设计细菌的遗传重组可以通过三种途径来实现：接合(conjugation)转化(transformation)转导(transduction)第三节细菌的接合与染色体作图一、接合（conjugation）现象的发现接合：指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)并发生重组的过程。1946年莱德伯格(Lederberg,J.)和塔特姆(Tatum)发现了细菌的接合。细菌的杂交实例（Lederberg&Tatum,1946）不同营养缺陷型的大肠杆菌：A菌株：met-bio-thr+leu+thi+（甲硫、生物素），B菌株：met+bio+thr-leu-thi-（苏、亮和硫胺素）这种原养型细胞如何出现的？回复突变？转化?互养作用?DavisU型管实验：A、B菌株分别培养在基本培养基上一边加压和吸引使培养液充分混合结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。结论：菌株A与菌株B细胞直接接触(接合)是原养型细胞出现的必要条件；两菌株直接接触后导致遗传物质转移，进而发生基因重组，产生原养型细菌。Hayes(1952)试验证明：接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质B菌株，从供体“donor”到受体“receptor”。（二）F因子及其转移不同营养缺陷型的大肠杆菌：A菌株：met-bio-thr+leu+thi+（甲硫、生物素），B菌株：met+bio+thr-leu-thi-（苏、亮和硫胺素）⑴F因子：致育因子（fertilityfactor）或称性因子（sexfactor），是一种附加体。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表示。（二）F因子及其转移⑵F因子的结构染色体外遗传物质（质粒），环状DNA，9×104bp，大约为大肠杆菌环状染色体的2%，具有40-60个蛋白质基因。F因子分为三个区域：重组区：有4个插入顺序（insertionsequence,IS），通过和宿主染色体上的IS同源重组或通过转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。自主复制区：有转移的起点和2个复制起点。复制起点OriT是在染色体转移时进行滚环复制时的复制起点；OriV是在营养时期，即游离在细胞质中独立复制时的复制起点。转移区：主要有合成性伞毛即F纤毛（Fpili）的操纵子。F纤毛是由性伞毛蛋白构成，呈管状，又叫接合管。通过接合管可将供体和受体细胞相联。共30kb长，有40个基因与DNA的转移有关。⑶F因子的三种状态②有一个自主状态的F因子，即F＋细胞；③带有一个整合的F因子的品系叫高频重组，Hfr细胞。①没有F因子，即F－细胞；F＋与F－菌（1）有F因子的细菌称为F＋，细菌增殖时可把F因子传递给后代细胞（通过自主复制）。（2）没有F因子的细菌称为F－，F＋细菌经吖啶橙处理而丢失，成为F－。F因子一经丢失，细胞中便不再出现；（3）F＋可以和F－杂交，而不能和F＋杂交；（4）F＋菌与F－菌混合（即F＋×F－）1小时后，约95%的F－菌转变为F＋菌，而原来的F＋仍然保留有F因子。且可以10－7频率获得重组体后代。(1)F纤毛（性伞毛）合成：由性伞毛蛋白构成，接合管使供体和受体细胞接触。(2)转移启动：F因子从转移复制起点(OriT)开始向F－转移（5’端首先进入受体）。(3)单链转移，滚环复制。F纤毛与接合管F＋×F－（三）高频重组(Highfrequencyrecombination,Hfr)1951年Cavalli发现：用氮芥处理F＋,然后将处理后的F＋与F－杂交，产生高频率的重组子（10－4）。1954年Hayes也分离了Hfr品系，发现：(1)Hfr使重组能力增强，但无传递F因子的能力，Hfr×F－时，F－菌很少变成F＋菌。(2)Hfr只能将供体基因组的一部分传给受体。Hayes的解释：Hfr的F因子发生了永久性改变。Hfr是F因子整合到E.coli染色体上的结果(1)E.coli染色体上有20个以上的整合位点；(2)整合通过IS3等同源重组或转座实现；(3)F因子有多个整合位点，主要在IS3处。（1）滚环复制；（2）随机中断；（3）F因子的致育区（转移区）在最末端，因而很难转移到F－。部分二倍体中的交换:单数交换：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。偶数交换：产生可遗传的重组体（重组子）和片段。部分二倍体：当F＋或Hfr的细菌染色体进入F－后，在一个短时期内，F－细胞内的某些位点就会成为二倍体的DNA。这种二倍体是供体的部分基因组（外基因子）与受体的完整的基因组（内基因子）构成，故称部分二倍体。细菌重组的特点：只有偶数交换才有效；相反的重组子不出现。细菌的交换过程第四节中断杂交与重组作图50年代，JacobF.和WollmanE.设计了中断杂交试验，证明接合时遗传物质从供体细胞向受体细胞的转移是直线式进行。他们将Hfr菌株与F-菌株混合在一起进行杂交:Hfr菌株：thr+leu+strsazirtonrlac+gal+F-菌株：thr-leu-strrazistonslac-gal-str代表链霉素，s代表敏感性，r代表抗性，+代表原养型，-代表缺陷型。一、中断杂交试验原理及作图•每隔一定时间取样，把菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断杂交经过稀释，接种到含有链霉素的完全培养基上，这样将杀死所有Hfr细胞对形成菌落的F-细胞用影印培养法测试其基因型，以确定每个基因转移到F-细胞的时间。Hfr菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F—细胞，即染色体从原点开始以直线方式进入F-细胞的。①8分钟时：thr+进入F-细胞。8.5分钟时：leu+进入F-细胞。②9分钟时：有少量叠氮化物抗性的菌落，少数azir基因进入F-细胞。③11分钟时：出现抗菌噬体T1的F-细菌。④18和25分钟时：分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，即lac+和gal+进入F-细胞。F因子是最后转移的：Hfr×F-继续进行，长达两小时，然后中断，发现有F-受体转变为Hfr，但效率很低。①重组体中各标志基因进入F-细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；②随时间的推迟，某个基因的重组率增加；到一定程度后，重组率不再增加。某一基因出现得越早，它所达到的百分数也越高。例如，azir出现最早，在24分钟时就达到了约90%的频率；gal+出现最迟，即使在混合60分钟时取样，也只有30%的菌落属于半乳糖利用型。可用基因出现的时间为指标，作出E.coli的遗传连锁图，距离的单位为分钟。大肠杆菌的染色体呈环状用大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交实验，作出连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序不同。差异：不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移方向不同。说明F因子和细菌染色体都是环状。F因子插入的位置和方向不同形成不同的Hfr菌株。二、重组作图两基因转移时间间距＜2分钟时，中断杂交法的图距不够精确，应采用传统的重组作图法Hfrlac+ade+strs×F-lac-ade-strr用时间单位法测得这两个基因间的距离是