基因敲除

主题：几种常用的基因敲除技术王怀玉研究基因功能的方法一：是通过增强其表达，取得表达产物进行研究。这种方法因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃二：是减弱或者终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功能者将基因与生物的整体功能联系起来考察，并能为基因的功能提供直接证据，因而其技术不断得到发展和完善简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。有一段序列:1234567890(原基因),敲除后为:“1237890”。一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如ABC,则新的基因为:123ABC7890；或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。基因敲除的发展基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。基因敲除的分类（一）利用同源重组进行基因敲除（二）利用随机插入突变进行基因敲除（三）RNA干扰引起的基因敲除一：利用同源重组进行基因敲除主要是利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导人靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合人内源基因组内，使外源基因得以表达条件性基因敲除（ConditionalKnockout)在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个LoxP（或Frt）序列，得到floxFlankedbyloxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段，但目前仍然存在一些问题。..(1)操作复杂，实验周期长，费用偏高;(2)对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能;(3)由于基因功能上的冗余，敲掉一个基因并并不能造成容易识别的表型,基因家族的其他成员可以提供同样的功能;基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法，但是对开花植物而言，缺乏高效实用的定点突变技术。目前较为有效的方法是大规模的随机插人突变，它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插人引起失活的目的基因等优点。T-DNA插人突变基因捕获法转座子插人突变利用随机插入突变进行基因敲除以农杆菌介导的T一DNA插人突变适用于多种植物，可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插人突变，而且插人位点的随机性较强，但是它只适用于那些容易被T一DNA转化的植物，以农杆菌介导的T一DNA插人突变适用于多种且常常会引起的染色体重排现象，使突变体表型与T一DNA插人无关而难以进行遗传学分析。尽管如此，近年来将T一DNA插人突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。T-DNA转移DNA（transferredDNA，T-DNA）：T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构。农杆菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。农杆菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。T-DNA是Ti质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（主要是双子叶植物）时分别诱发根瘤，opine化合物的合成和抑制细胞分化。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体。而外基因就是整合到T-DNA上的。转座子插人突变目前研究报道，能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini-Mu转座子(每个转座子上都携带标记基因)，它们可以在拟删除基因两侧各插人一个mini-Mu转座子，然后在两个插人位点之间的制造缺失。这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移，留下一个带有选择性标记在两侧的与靶基因同源的臂。转座子转座子是一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列.转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。转座子的应用也有一定限制，比如要求转座子本身较短，容易操作，且对任何拟敲除区域有较高转座效率等。转座子插人突变利用mini一Mu转座子进行基因敲除具有极大的方便性，它不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可，且载体构建迅速，技术简单，载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。优点限制基因捕获法基因捕获法：基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。此方法基因的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因。RNAinterference由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。是特异识别双链RNA的一种酶，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)Dicer酶RdRP以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA-directedRNApolymerase双链RNA进入细胞siRNA复合物Dicer酶裂解RdRP诱导扩增双链RNADicer酶裂解解开变成单链结合某些蛋白复合物+与siRNA互补的mRNAmRNA被RNA酶裂解以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成mRNA互补链双链mRNADicer酶裂解siRNA复合物聚合酶链式反应抑制基因表达对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用