细胞培养基本技术(一) 2016-3

1细胞培养实验技术现代生物实验室的‘基石’技术2中科院院士：“现在研究生和以前中专生没区别！总的感觉，毕业生质量在下滑。比如来的一些研究生，你会感觉到他的动手能力和理论基础不是很令人满意。”2014全国两会3全国政协委员李志军：有本科生毕业不能直接上手，不如技校生•2016全国两会4一、细胞培养的基本知识二、细胞培养的实验用品及用途三、各种实验用品的清洗与消毒四、各种液体的配制方法目录5一、细胞培养的基本知识6组织细胞培养概念•习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养，组织培养，和细胞培养的总称。即：在无菌条件下,从动物(植物也可)或在人体中取出组织或细胞,置于模拟体内的生理环境中(无菌,适当的温度和一定的营养条件)使之生存和增殖生长的技术方法。•用于研究细胞、组织的代谢、增殖、分化、形态和功能变化，各种理化因子对活细胞的影响。•按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等7细胞培养（cellculture)是指用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培养。组织培养（tissueculture)是指把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。其特点是：组织不失散，细胞保持原有的组织关系。器官培养（organculture）是将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。其特点是：培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1年。8910细胞培养可分为群体培养和克隆培养•群体培养（massculture）：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。•克隆培养（cloneculture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。•研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法。11群体培养（左）和克隆培养（右）12体外培养细胞的生物学特点•1、体外细胞的分化特点•2、体外培养细胞的分型•3、组织培养细胞的生长和增殖过程131、体外细胞的分化特点•在个体发育过程中，子代细胞产生形态、结构和功能差异的过程称为细胞分化。•体外培养的细胞由于失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，经多次传代增殖，久之则发生如下变化：1.分化现象逐渐减弱或不显，形态与功能趋于单一化，或传一定代数后衰老死亡；2.发生转化，获不死性而成为能无限传代的连续细胞系或恶性细胞系。142、体外培养细胞的分型•上皮细胞型贴壁型细胞成纤维细胞型游走细胞型•悬浮型细胞15贴壁(粘附)型细胞•通常将必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴壁依赖性细胞。•体外培养时：组织细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴壁（粘附）型细胞。•活体内的细胞当离体培养时大多数均以贴附型方式生长。本课程主要讨论本型细胞的培养。•目前已有很多种细胞能在体外培养生长，包括正常细胞和肿瘤细胞。例如：成纤维细胞、骨骼组织(骨及软骨)、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺、皮胺、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。16细胞在体内、外的粘附方式：(存在差异)体内：粘附是全方位。外形具有复杂的立体特征。体外：多数情况，细胞只有一个附着平面。外形一般与体内时明显不同.171.上皮样细胞型名称：仅形态上似体内的上皮细胞，实际上不完全等于体内同名的细胞。组织来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤•细胞形态：类似体内的上皮细胞。扁平，不规则多角形，中有圆形核。培养中的上皮样细胞形态为扁平的多角形，其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，呈“铺路石”状，具有连接成片的能力。18生长特点：易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动192.成纤维样细胞名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞组织来源：由中胚层间质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞细胞形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核20生长特点排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起21体外培养的成纤维细胞（左）HeLa细胞（右）倒置显微镜图22体外培养的平滑肌细胞（免疫组织化学染色显示肌动蛋白）233.游走型细胞(不定型)：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。常见于羊水细胞培养的早期游走型细胞多形型细胞24贴附生长细胞的特点•1.与体内同名的细胞不完全相同如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源，自同一动物不同组织的成纤维样细胞，形态相似，但发展趋向不同。2.培养细胞的形态不稳定培养条件改变时，细胞形态可有变化。25培养细胞形态不稳定血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞PH值Hela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样26悬浮生长型细胞概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。来源血液，脾或骨髓，尤以血中白细胞多见，癌肿细胞也可能。特点在悬浮液中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团。27优点生存空间大，提供细胞数量大，细胞传代方便(不需消化)易于收获细胞可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)悬浮生长型细胞283、组织培养细胞的生长和增殖过程•细胞周期•细胞培养一代的生长过程•体外培养细胞的分期29细胞周期•细胞周期=G1期+S期+G2期+M期•G1期（DNA合成前期）主要发生DNA合成前的有关生化变化•S期（DNA合成期）主要发生DNA合成•G2期（分裂前期）DNA含量加倍，以及RNA的合成和染色质的螺旋化•M期（分裂期）主要完成细胞遗传物质的分配30DNA合成期分裂期DNA合成前期分裂前期31细胞培养一代的生长过程组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增(Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另一培养瓶皿内生长的过程。32每代贴壁细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）33游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。34贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟～4小时贴壁。粘附底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着。进口塑料培养瓶多涂有生长基质（化学合成的功能基团）35贴附过程：贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着—伸展36细胞粘附过程3738影响细胞贴壁的因素1.各种细胞粘附强弱：巨噬细胞(附着最强)成纤维样细胞上皮样细胞血细胞(最弱)2.生物因素：血清、培养液中的促附着因子3.机械，物理等因素:离心：促进附着流动：培养液流动可阻止细胞附着低温：可抑制附着39促进细胞粘附措施1.包被对分化程度高、生长能力差的细胞，可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质.如:通过其所带电荷先吸附,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分细胞本身也可能产生一些粘附分子2.减少接种时细胞培养液的量：待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液。3.减少培养液中血清的含量，使培养液黏度降低。4.培养液中离子成分及其浓度。如，培养液中的Ca含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展。5.培养液的温度:低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁。40潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。41对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。42停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。•机制：接触抑制、密度依赖性。（接触抑制：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞的表面相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不进入S期。）密度抑制（densityinhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。43细胞的接触抑制44细胞的生长曲线45•1.原代培养期•2.传代期•3.衰退期体外培养细胞的分期46原代培养期•取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前的阶段称为原代培养。原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续1～4周。47•传代期细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中生长（不论稀释与否）。持续时间最长，其特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。•衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。48原代细胞培养的流程49原代培养期传代期衰退期50体外培养细胞生长的条件1细胞的营养需要：氨基酸、单糖、维生素、无机离子、微量元素、激素、生长因子等2细胞的生存环境•温度:37℃•O2•CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-•pH:7.2-7.4•渗透压3无污染4无毒51培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。52天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）•优点：营养成分丰富，培养效果好•缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染53合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。•合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。•优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。•缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。54•人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。55血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分的物质56使用血清的缺点•对多数细胞，在体内状态时，血清不是它们接触的生理学液体，只是在伤愈或血凝过程中才可接触，因此血清的使用有可能改变某种细胞的状态。•血清中含有一些有毒性的物质，例如：多胺氧化酶，补体，抗体，细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡。•每批血清之间，成分不能保持一致。•取材过程可能带入支原体、病毒，可能导致实验失败或结果的不可靠。57选择血清需注意：•血清质量好坏是实验成败的关键。•常用血清有胎牛血清（剖腹产）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（10～30D）、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。•优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。•血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟•血清的消毒：过滤除菌58•一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．•对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．•血清中不仅存在促细胞生长因子