第14章基因重组和基因工程3

目录基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第14章目录DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆目录DNA克隆、测序与重组技术的历史1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久，Sanger等的双脱氧测序法目录DNA克隆、测序与重组技术的历史20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology)CraigVenter目录第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequentlyinNature目录目录DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)目录发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式目录Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：目录是在二倍体生物细胞中，形态、结构基本相同的染色体，并在减数第一次分裂的四分体时期中彼此联会，最后分开到不同的生殖细胞（即精子、卵细胞）的一对染色体，在这一对染色体中一个来自母方，另一个来自父方。同源染色体内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录片段重组体（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录片段重组体拼接重组体目录PotterH.和DresslerD.在噬菌体中的拍摄到“十”字型结构的DNA电镜照片，为Holliday模型提供了一个有力的证据。目录二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。目录质粒是染色体以外能自身独立复制的超螺旋共价闭环双链DNA分子。质粒目录可接合质粒如F因子(Ffactor)目录目录（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。目录例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录目录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)目录目录（四）细菌融合两个不同种类的细菌融合成为一个新的物种。目录TwoBacteriaSpeciesMergingIntoOneCampylobacterjejuniandCampylobactercoli,astheintestinalorganismsareknown,aren'tjustconsummatingtheirmicroscopiclovebyexchanginggenes—they'remergingintoasinglespecies,scientistssay.Theresearchersthinkthemarriageofthecreaturesrepresentsaprofoundexampleofhowpeoplecanaffectevolution.目录三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。目录λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。（一）λ噬菌体DNA的整合目录（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。目录hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。目录H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程保守的重组信号序列目录四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。目录插入序列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列转座•二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列•特有的正向重复序列•一个转座酶（transposase)编码基因目录插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)插入序列的复制性转座目录转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因目录细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录由转座子介导的转座目录第二节重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone目录重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系本节主要内容：目录一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆目录技术水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆目录生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录GeneticEngineeringFirst,thenucleusofhumancellsareburstHumancellNucleus目录GeneticEngineeringThechromosomesarecutupintosmallfragmentsandtherequiredgeneidentified.ChromosomefragmentsFragmentcontainingrequiredgene目录GeneticEngineeringNextthefragmentsarespreadoutandtherequiredoneisolated.Segmentwithrequiredgene目录GeneticEngineeringCytoplasmBacterialchromosomeBacterialcellwallPlasmidStructureofatypicalbacterium目录GeneticEngineeringPlasmidPlasmidsareloopsofDNAseparatefromthemainchromosome.Theycarrygenesforthingslikeantibioticresistance.ThismakesthemveryusefultotheGeneticengineer.目录GeneticEngineeringIntheaboveplasmid,theYELLOWgeneisonethatgivesthebact