细胞生物学实验技术(一)

动物细胞生物学实验技术主要内容第一节培养细胞的细胞生物学第二节细胞培养第三节显微镜知识第四节细胞生物学实验技术第一节培养细胞的细胞生物学主要内容（一）体内、外细胞的差异（二）体外培养细胞的分型（三）培养细胞的生长和增殖过程•体外培养的细胞和体内细胞的比较–相似：仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系•单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止细胞相互沟通生物信息的结果•对细胞外基质仍有依存性–差异：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不明显•细胞外基质–存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。–这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。1．影响细胞的存活、生长与死亡正常真核细胞，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为定着依赖性（anchoragedependence）。例如，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。2．决定细胞的形状•细胞呈单个游离状态时多呈球形。•同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附时可表现出完全不同的形状。•细胞外基质决定细胞的形状这一作用是通过其受体影响细胞骨架的组装而实现的。3．控制细胞的分化•细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。–例如，成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。•4．参与细胞的迁移•细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。•细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基质时诱导粘着斑的形成，粘着斑是联系细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。（一）体内、外细胞的差异–体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响–体外：缺乏动态平衡的稳定环境–发生的变化•分化现象减弱•形态功能趋于单一化•一定时间后死亡或者转化获得不死性•体外培养的细胞仍具有研究的意义–许多性状仍与体内相同•如体外培养的心肌细胞仍可博动，–细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭／开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。（二）体外培养细胞的分型–贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按体内组织学标推判定–悬浮型：见于少数特殊的细胞，白血病细胞，骨髓细胞或免疫细胞，不需要细胞间和细胞与培养表面的接触。•贴附型细胞的分类–成纤维细胞型–上皮型细胞–游走细胞型–多型细胞型•成纤维细胞型–梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。–除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。–凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。–上皮型细胞：•扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动，细胞很少单独行动。•起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。•游走细胞型：–散在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。–此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。•多型细胞型：–有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（三）培养细胞的生长和增殖过程•培养细胞的生命周期–是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。–种类、供体的年龄等。•人胚成纤维细胞可传30～50代，约150～300个增殖周期，能维待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纤维细胞仅可传几代•供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；•肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。•当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。•生命周期的三个阶段–原代培养期–传代期–衰退期•原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养到第一次传代。原代培养（PrimaryCulture）期•原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上相似性大。•特点–细胞群是异质的（Heterogeneous）–细胞克隆形成率（CloningEfficiency）低，即细胞独立生存性差。–由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象•原代培养分为两种方法–直接接种组织块–由组织分离出细胞后接种组织块接种：牛胎儿成纤维细胞•传代期：–原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。此期的持续时间最长。–在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。–为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。–一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。•衰退期：–增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。–少数情况下，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性质（Malignancy）。这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。–无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞的一代生存期1．潜伏期（LatentPhase）2．指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）3．停滞期（StagnatePhase）1．潜伏期（LatentPhase）–细胞接种培养后，先是悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。–接着细胞贴附于底物表面，称贴壁，–各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。–经过延展过程变成极性细胞–可运动，基本无增殖。–细胞接种密度大时潜伏期短。–当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。不同的细胞贴壁的时间不同如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强,能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱,需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着—伸展•细胞贴壁影响因素–生物因素：血清、培养液中的促附着因子–机械、物理等其他因素：•流动：培养液流动可阻止细胞附着•离心：促进附着•低温：可抑制附着•加速细胞贴壁的措施–包被培养皿底面：对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质如:--通过其所带电荷先吸附培养皿底部,培养的细胞再与其结合。–血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分–减少接种时细胞悬液的量，待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液•培养液中离子成分及其浓度–如，培养液中的Ca含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展•合适的培养温度•细胞铺展（伸展）(spread)–进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为–铺展状况制约细胞的分裂增殖活动–铺展的过程•细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细，铺展的越好与生长基质的表面接触面越大–极性细胞就是细胞在体外的特征性细胞形态–铺展状况与细胞的生长有密切关系•只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行2，指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）–是细胞增值最旺盛的阶段，是细胞一代中活力最好的时期,是进行各种实验最好的和最主要的阶段。–以细胞分裂指数（MitoticIndex：MI）作为判定细胞生长旺盛与否的重要标志。即每1000个细胞中的分裂相数。•体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，原代细胞分裂指数低，永生细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响2，指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）–接触抑制（ContactInhibition）•由于细胞增殖而的相互接触，进而抑制细胞的运动和增殖，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。•恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。•接触抑制是创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央爬行时,一旦上皮细胞互相接触,就停止分化和增殖。该现象就叫接触抑制。因此,创面上不会出现多余的皮赘。这也是一种十分巧妙和神秘的调控现象。接触抑制（Contactinhibition）•细胞相互接触时，将停止增长；•细胞停留在细胞周期的G0期；•转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。3．停滞期（StagnatePhase）：•细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。•停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。•此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。第二节、细胞培养主要内容（一）细胞培养所需条件（二）细胞培养所需用品（三）细胞培养液（四）细胞的原代、继代培养（五）细胞的冻存和复苏（六）细胞污染（一）细胞培养所需条件1营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压湿度3无污染4无毒（二）细胞培养所需用品：•无菌间、超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯•CO2培养箱•倒置显微镜•液氮罐•自动双重纯水蒸馏器，纯水仪•耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管1．超净工作台(Hood):A.水平流超净工作台(Horizontalairflow)B.垂直流超净工作台(Lateralairflow)C.层流空气超净工作台(Laminarairflow)水平流超净工作台背送风，但病毒是不实用的，容易对人有害垂直流超净工作台超净工作台的清洁维护：保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，即试验完毕后，将所有的用品收藏起来，工作台上只留有酒精灯及橡皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误2，CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，100%湿度，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。湿度以第二天第一次开门，能看到玻璃门上的水珠3．消毒设备：A.高压消毒锅（Autoclave）：110ºC，15lb，20分钟，适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体（9lb，10分钟）等。消毒后必须在烤箱中低温烤干。B.干热消毒箱：150-200ºC，2-3小时。适合于玻璃器皿、金属器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、动物皮毛等，酒精浓度为75－95％。高压消毒锅D.滤膜过滤：正压过滤:蠕动泵通入培液；通入气体。负压过滤：用水泵或油泵抽滤。滤膜孔径为0.22μm，为延长滤膜寿命可同时添加0.45μm和1.2μm滤膜。滤膜滤器两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）4.蒸馏器与去离子纯水系统：1）用三蒸水，通过去离子纯水系统，电阻需达到