饲料中粗蛋白测定

实验二饲料粗蛋白的测定饲料粗蛋白测定的意义：•蛋饲料中含氮物质包括蛋白质和非蛋白质含氮化合物，两者总称为粗蛋白。•蛋白质是畜禽日粮中最主要的物质之一，蛋白质是生命的物质基础。测定饲料中蛋白质的含量，对于初步评价饲料的营养价值、合理开发利用饲料蛋白资源、提高产品质量、优化饲料配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。蛋白质测定方法：1．直接法根据蛋白质的物理、化学性质直接测定蛋白质含量双缩脲法Folin—酚试剂法（Lowry法）紫外吸收法（最常见的280nm）考马斯亮兰法（Bradford法）－染料结合法2．间接法通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据：每种蛋白质的含氮量是恒定的，N×6.25）。凯氏定氮法杜马斯燃烧定氮法强碱直接蒸馏法饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法凯氏定氮法是9世纪建立的经典方法，结果可靠但操作费时。在经典法基础上选择催化剂，加快分析速度，改进仪器装置。是目前饲料中粗蛋白分析最常用的方法。适应范围：本方法适用于配合饲料、浓缩饲料精料补充料和单一饲料。测定原理：饲料的有机物质在催化剂（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和氨态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成氨，并被浓硫酸吸收成为硫酸铵；而非含氮物质，则以CO2，H2O，SO2状态逸出。消化液在浓碱的作用下释放出氨，通过蒸馏，氨随汽水顺着冷凝管流入硼酸吸收液中，并与其结合成硼酸铵，然后以甲基红—溴甲酚绿作混合指示剂，用盐酸标准溶液滴定，求出氨的含量，再乘以一定的换算系数，即得出试样中粗蛋白的含量。测定原理：•①样品消化•2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O•②氮的蒸馏•2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O•NH3+H3BO3=NH4H2BO3•③滴定•NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3浓硫酸的脱水性与强氧化性仪器设备：•分析天平：感量0.0001g•消煮炉或电炉•酸式或通用滴定管：25mL，50mL•消化管或者凯氏烧瓶：250mL•开始蒸馏装置：常量直接蒸馏或半微量蒸馏式•三角瓶：150mL，250mL•容量瓶：100mL•定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动和全自动蛋白质测定仪。试剂与溶液：•浓硫酸：化学纯•混合催化剂：0.4g硫酸铜（CuSO4·5H2O），6g无水硫酸钾或无水硫酸钠，磨碎混匀。•400g/L氢氧化钠溶液：400g氢氧化钠（化学纯）溶于1000mL水中。•20g/L硼酸溶液：20g硼酸（化学纯）溶于1000mL水中。•盐酸标准滴定溶液：用基准物质碳酸钠，按附录八进行标定。•c（HCl）=0.1mol/L：8.3mL浓盐酸，注入1000mL水中（用于常量定氮法）•c（HCl）=0.02mol/L:1.67mL浓盐酸，注入1000mL水中（用于半微量定氮法）•混合指示剂：1g/L甲基红乙醇溶液与5g/L溴甲酚绿乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期为三个月。•硫酸铵：分析纯、干燥•蔗糖：分析纯•硼酸吸收液（全自动定氮仪用）：10g/L硼酸溶液1000mL，加入1g/L溴甲酚绿乙醇溶液10mL，40g/L氢氧化钠溶液0.5mL混合，置阴凉处保存期为1个月。CuSO4的作用防止飞溅实验步骤：•（1）试样的消化•电炉消化：称取0.2~0.4g试样（含氮量5~80mg），准确至0.0002g,放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入浓硫酸10mL和2粒玻璃珠。将凯氏烧瓶放在通风柜里的电炉上或凯氏消化架上小心加热。开始小火，待样品焦化，泡沫消失，再加大火力，并消化直至溶液呈透明的蓝绿色后，再加热消化15min。•消化管消化：称取0.2~0.4g试样（含氮量5~80mg），准确至0.0002g,放入消化管中，加入6.4g混合催化剂与试样混合均匀，或加入2片商业消化片，再加入浓硫酸10mL，于420℃下消化炉上消化60~90min,取出后冷却，用少量蒸馏水冲洗消化管帽。建议消化炉消化程序一般设定为：200℃，30min；420℃，60~90min。消化时间不宜过长，会使测定结果偏低防止水中氨态氮的逸失而影响测定值。实验步骤：（2）氨的蒸馏①半微量蒸馏法半微量蒸馏法使用凯氏定氮法定氮装置。将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中。冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。取20mL/g硼酸溶液35mL于锥形瓶中，加2~3滴混合指示剂，使半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入此溶液。蒸汽发生器中的水应加入甲基红指示剂数滴、硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此溶液为橙红色，否则需补加浓硫酸。准确移取试样分解液10~20mL，注入蒸馏装置的反应室内，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加400g/L氢氧化钠溶液10mL，小心拉起玻璃塞使之进入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水封好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。使NH3全部吸收进硼酸最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！1———电炉;2———水蒸气发生器(2L烧瓶);3———螺旋夹;4———小玻杯及棒状玻塞;5———反应室;6———反应室外层;7———橡皮管及螺旋夹;8———冷凝管;9———蒸馏液接收瓶。凯氏半微量定氮装置冷凝管的水流方向？实验步骤：②常量蒸馏法。常量法蒸馏法使用凯氏半自动定氮仪。将试样消煮液冷却加入60-100mL水，摇匀，冷却。将蒸馏装置冷凝管的末端浸入盛有35mL硼酸吸收液和加2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地将消化管装入仪器中，然后向消化管中加入400g/L氢氧化钠溶液40mL(或至溶液颜色变黑，再加少许)使溶液混匀后再加热蒸馏5min,或至蒸馏出液体积约为150mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1min,并用水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。开始半自动定氮仪使NH3全部吸收进硼酸校正药品不纯带来的误差溴甲酚绿—甲基红指示剂变色范围为5.0-5.2，pH5.0以下为暗红色，pH5.1为灰绿色，5.2以上为绿色实验步骤：•（3）滴定。半微量蒸馏法或常量定氮法蒸馏后的吸收液，分别立即用0.02mol/L或0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。•（4）空白测定。称取蔗糖0.5g，以代替试样，按（1）试样的消化测定步骤进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积不超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准滴定溶液的体积不超过0.3mL。•（5）蒸馏步骤的检验。精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按以上（1）和（2）测定步骤操作，测得硫酸铵含氮量为（21.19±0.2）%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。实验步骤：•（6）结果计算与表示•半微量定氮法和常量定氮法试样中粗蛋白质质量分数分别按式下面两式计算。式中:c为盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；m为试样质量，g;V2为滴定试样时所消耗盐酸标准滴定溶液体积，mL;V0为试样分解液蒸馏用移取体积，mL;0.014为与1.00mL盐酸标准滴定溶液[c(HCL)=1.000mol/L]相当的、以克表示的氮的质量;6.25为氮换算成蛋白质的平均系数。•每个试样取两平行样进行测定，以其算数平均值为结果。结果保留小数点后两位。201V-V*c**VCP=*mV（）0.0146.25（）20V-V*c*0.014*6.25CP=m（）（）实验步骤：•7.重复性•当粗蛋白质含量在25%以上，允许相对偏差为1%;当粗蛋白质含量在10%~25%，允许相对偏差为2%；当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。注意事项：•消化时应经常转动凯氏烧瓶，以使消化得以快速而完全。•凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露。•蒸馏完毕应先取下接收瓶，然后关闭电源，以免酸液倒流。•一次蒸馏后必须彻底洗净碱液，以免再次使用时引起误差。•含硝酸盐较多的饲料，用凯氏定氮法测定粗蛋白时，很多硝酸盐因还原而损失。•各种饲料的粗蛋白质中实际含氮量差异很大，其变异范围在14.7%~19.5%，平均为16%。反饲料的粗蛋白质中氮含量尚未确定的，可用6.25平均系数乘以氮量换算成粗蛋白质量。反饲料中的粗蛋白质的含氮量已经确定的，可用他们的实际系数来换算。实验结果的讨论与分析：根据测得的实验数据，计算该样本饲料中粗蛋白含量。标准滴定溶液的配制及标定一般规定•1除另有规定外,本标准所用试剂的级别应在分析纯(含分析纯)以上,所用制剂及制品,应按GB/T603的规定制备,实验用水应符合GB/T6682中三级水的规格。•2本标准制备标准滴定溶液的浓度,除高氯酸标准滴定溶液、盐酸-乙醇标准滴定溶液、亚硝酸钠标准滴定溶液[c(NaNO2)=0.5mol/L]外,均指20℃时的浓度。在标准滴定溶液标定、直接制备和使用时若温度不为20℃时,应对标准滴定溶液体积进行补正(见附录A)。规定“临用前标定”的标准滴定溶液,若标定和使用时的温度差异不大时,可以不进行补正。标准滴定溶液标定、直接制备和使用时所用分析天平、滴定管、单标线容量瓶、单标线吸管等按相关检定规程定期进行检定或校准,其中滴定管的容量测定方法按附录B进行。单标线容量瓶、单标线吸管应有容量校正因子。•3在标定和使用标准滴定溶液时,滴定速度一般应保持在6mL/min~8mL/min。•4称量工作基准试剂的质量小于或等于0.5g时,按精确至0.01mg称量;大于0.5g时,按精确至0.1mg称量。•5制备标准滴定溶液的浓度应在规定浓度的±5%范围以内。•6除另有规定外,标定标准滴定溶液的浓度时,需两人进行实验,分别做四平行,每人四平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差[CR0.95(4)r=0.15%],两人共八平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差[CR0.95(8)r=0.18%]。在运算过程中保留5位有效数字,取两人八平行标定结果的平均值为标定结果,报出结果取4位有效数字。需要时,可采用比较法对部分标准滴定溶液的浓度进行验证。•7本标准中标准滴定溶液浓度的相对扩展不确定度不大于0.2%(k=2)。•8本标准使用工作基准试剂标定标准滴定溶液的浓度。当对标准滴定溶液浓度的准确度有更高要求时,可使用标准物质(扩展不确定度应小于0.05%)代替工作基准试剂进行标定或直接制备,并在计算标准滴定溶液浓度时,将其质量分数代入计算式中。•9标准滴定溶液的浓度小于或等于0.02mol/L时(除0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠、氯化锌标准滴定溶液外),应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释(不含非水溶剂的标准滴定溶液),必要时重新标定。当需用本标准规定浓度以外的标准滴定溶液时,可参考本标准中相应标准滴定溶液的制备方法进行配制和标定。•10贮存:•a)除另有规定外,标准滴定溶液在10℃~30℃下,密封保存时间一般不超过6个月;碘标准滴定溶液、亚硝酸钠标准滴定溶液[c(NaNO2)=0.1mol/L]密封保存时间为4个月;高氯酸标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液、硫酸铁(Ⅲ)铵标准滴定溶液密封保存时间为2个月。超过保存时间的标准滴定溶液进行复标定后可以继续使用。•b)标准滴定溶液在10℃~30℃下,开封使用过的标准滴定溶液保存时间一般不超过2个月(倾出溶液后立即盖紧);碘标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液一般不超过1个月;亚硝酸钠标准滴定溶液[c(NaNO2)=0.1mol/L]一般不超过15d;高氯酸标准滴定溶液开封后当天使用。•c)当标准滴定溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时,应重新制备。•11贮存标准滴定溶液的容器,其材料不应与溶液起理化作用,壁厚最薄处不小于0.5mm。•12本标准中所用溶液以“%”表示的除“乙醇(95%)”外其他均为