第八章 模拟酶

第八章模拟酶模拟酶又称人工合成酶，是一类利用有机化学方法合成的，比天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。化学人工酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。模拟酶在结构和必须具有两个特殊部位:①底物结合位点，②催化位点。一般构成底物的结合位点比较容易，而构建催化位点比较困难，但两个位点可以分开设计。设计模拟酶催化基团的定向引入对催化效率的提高至关重要。要考虑到与底物的定向结合的能力。催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力是相当重要的。设计人工酶模型应考虑：非共价键相互作用是生物酶柔韧性可变性和专一性的基础，故酶模型应为底物提供良好的微环境，便于与底物，特别是反应的过渡态以离子键、氢键等结合；精心挑选的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近，以促使反应定向发生；模型应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。第一节模拟酶的分类小分子仿酶体系：环糊精、冠醚、环番、环芳烃、卟啉等大环化合物大分子仿酶体系：聚合物酶模型、分子印迹酶模型、胶束酶模型等一.根据Kirby分类法单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子二.按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶环糊精结构示意水解酶模型ß-Benzyme人工酶，能模拟胰凝乳蛋白酶活性，催化速度达天然酶同一数量级。由ß-环糊精和催化侧链组成，催化侧链含天然酶的三种基团（羟基、咪唑基和羧基），且处在恰当位置上。该全合成酶是非蛋白分子，比天然酶稳定。研究热点CD分子原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用2、胶束酶模型3、肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。4、半合成酶它是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。1.将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合，形成半合成酶。如：钌(Rn)电子传递催化剂[Rn(BH3)5]3+与巨头鲸肌红蛋白结合——半合成无机生物酶2.将具有特异性的物质与具有催化活力的酶相结合，形成半合成酶。例：人工合成寡聚核苷酸链经化学法连接到RNA酶的166位的Cys上，获得的半合成酶借寡聚核苷酸链的碱基互补关系，显示了对RNA链特定位点的水解作用，——不同于DNA限制性内切酶的天然来源的RNA限制性内切酶。黄素木瓜蛋白酶——著名的人工酶将辅酶引入蛋白质上制备半合成酶：E.T.Kaiser等构建的黄素木瓜蛋白酶。黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的Cys25共价结合成黄素木瓜蛋白酶。此半合成酶的酶活力可与天然黄素酶相比拟。其他的辅酶(如维生素Bl、吡哆醛、卟啉等)都可以共价偶联到某些酶的结合部位．从而产生新的实用催化剂。第二节印迹酶一、分子印迹技术概述模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富挑战的课题之一。在分子水平上模拟酶对底物的识别与催化功能已引起各国科学工作者的广泛关注。自然界中，分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。分子印迹这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合物中产生呢？如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像‘‘锁”一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。所谓分子印迹(molecularimprinting)是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，这个化合物叫印迹分子(printmolecule，P)，也叫做模板分子(template，T)。分子印迹(一)分子印迹原理在生物体中，分子复合物通常通过非共价键如氢键、离子键或范德华力相互作用而形成。同共价键相比，非共价键相互作用较弱，但几个或多个相互作用的合力却很强，这使复合物具有很高的稳定性。当模板分子(印迹分子)与带有官能团的单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来。当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部位，这样的结合部位对模板分子可产生多重相互作用，因而对此模板分子具有特异性结合能力。分子印迹制备步骤①选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；②在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应；③用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。用抽提法从聚合物中除去印迹分子。则聚合物中留有恰似印迹分子的空间，可用于高分子高选择性分离材料。此技术又叫主一客体聚合(Host-GuestPolymerization)或模板聚合(TemplatePolymerization)。形成的聚合物（MIP）内保留有与印迹分子的形状、大小完全一样的孔穴，也就是说印迹的聚合物能维持相对于印迹分子的互补性，因此，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。一般来说，聚合物空穴对印迹分子的选择性结合作用来源于空穴中起结合作用的官能团的排列以及空穴的形状。大量研究表明官能团的排列在空穴特异性结合中起决定性作用，而空穴的形状在某种程度上是次要因素。印迹分子与聚合单体的结合方式预组织法：印迹分子预先共价联结到单体上，待聚合后共价键可逆打开，去除印迹分子。此方法中结合部位的官能团预先与印迹分子定向排列。自组织法：印迹分子与功能单体之间预先自组织排列，以非共价键形式形成多点相互作用，聚合后这种作用保持下来。影响印迹分子选择性识别的因素①底物结构和互补性：底物必须与模板分子的结构、大小相似，孔穴内的功能基团要排列正确，要有适当取向。②聚合物与模板分子间作用力：增加二者间的多种作用力，且键的数目又多，可大大改善聚合物的识别能力。③交联剂的类型和用量：交联少会减低聚合物的坚固程度，难于限定负责选择性部位的形状和其中的基团取向，导致识别力下降。使用旋光性交联剂，则可能造成与模板分子有附加的手性相互作用，提高识别力。④聚合条件：低温聚合较好从人工酶角度来看，若用过渡态类似物作为印迹分子，则所得聚合物具有相应的催化活性，此时代替抗体的只是人工聚合物。分子印迹技术一出现，人们就意识到可以应用此技术制备人工模拟酶。分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。要想制备出具有酶活性的分子印迹酶，选择合适的印迹分子是相当重要的。目前，所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物以及产物等。1.印迹分子的选择：研究表明以产物为印迹分子的印迹聚合物表现出最高的酶催化效率。2.催化基团的定位：将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要。通常引入催化基团的方法为诱导法，即通过相反电荷等的相互作用引入互补基团。3.存在的问题：用高聚合物制备的印迹酶其催化效率普遍不高。可能的原因：①分子印迹聚合物一般是高交联聚合物，其刚性大且缺乏酶的柔性。②用于聚合的单体种类较少，使得模板与空腔周围基团形成次级键的作用力减少。也就是说模板聚合物对反应底物的识别能力受到限制，因而导致酶活力普遍不高。蛋白质表面印迹在聚合物涂层的硅石上的示意生物印迹(bioimprinting)生物印迹是指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消，其构象被固定，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化在移入无水有机相后才能得以保持。用这种方法可以制备生物印迹酶。非水相生物印迹酶制备示意图在有机相中,生物印迹蛋白质由于保持了对印迹分子的结合构象而对相应的底物产生了酶活力，那么这种构象能否在水相中得以保持，从而产生相应的酶活力呢？水相生物印迹酶研究结果表明，采用交联剂完全可以固定印迹分子的构象，在水相中产生高效催化的生物印迹酶。利用这种方法已成功地模拟了许多酶(如酯水解酶、HF水解酶、葡萄糖异构酶等)，有的甚至达到了天然酶的催化效率。制备生物印迹酶的主要过程为：①首先使蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象；②加入印迹分子，使印迹分子与部分变性的蛋白质充分结合；③待印迹分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印迹的蛋白质；④经透析等方法除去印迹分子。由于起始蛋白质与印迹分子充分作用后，就产生了类似于酶的新的活性中心，从而赋予了新的酶活力。对这种印迹来说，起始蛋白质既可以是无酶活力的蛋白质(如牛血清蛋白等)，又可以是具有催化活力的酶，而印迹分子通常是某种酶的抑制剂、底物修饰物或过渡态类似物等。