酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体

酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立小组成员：王哲鉴、钟鑫陈阳、刘一宁指导教师：綦霞所在院系：检验医学院CompanyLogo目录摘要1实验方法2结果讨论34致谢CompanyLogo摘要目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。摘要摘要结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体的实验体系结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“O”抗体实验方法实验材料：实验动物：家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员2.与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体3.体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行）实验试剂：饱和硫酸铵溶液PBS透析液辣根过氧化物酶(HRP)NaIO4溶液2.5%乙二醇溶液硼氢化钠溶液包被稀释液酶标抗体待测抗体稀释液洗涤液底物液实验器材：兔笼透析膜离心机加样器酶标板CompanyLogoCompanyLogo实验步骤1234制备伤寒O抗体纯化抗体酶与抗体的连接ELISA竞争检测伤寒O抗体（预实验和正式实验）制备伤寒O抗体颗粒性抗原伤寒杆菌备注第一周第一天耳缘静脉注射0.1ml之前取血0.7-1ml，分离血清，待用第二天耳缘静脉注射0.2ml第三天耳缘静脉注射0.2ml第四天耳缘静脉注射0.5ml第二周加强免疫：皮下注射1.0ml（两侧各0.5ml）第三周耳中央动脉采血，分离血清纯化抗体1份血清（5ml）+1份生理盐水+2份饱和硫酸铵置试管中2000转离心20min弃上清1.5~2mlNS溶解沉淀透析24h收集、标记、冰冻5管缓缓摇动,室温2h（1.5h）盐析法酶与抗体的连接实验原理：NaIO4是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：实验方法：标记过程：1.将HRP5mg溶于0.5mlPH5.6HAC-NaAc缓冲液中（老师做）。2.滴入NaIO40.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。4℃作用30min。酶与抗体的连接3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（稳定剂）终止反应，室温30min。4.加入待标Ab1.5~2.0ml,用pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至9.0左右，4℃过夜。5.加入0.1ml硼氢化钠，4℃2小时。6.pH7.4PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体（一）.酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验1.包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100μl，置37℃作用4h或4℃作用24h。2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次1min，于吸水纸上充分拍干。3.加入样品：每孔加入酶标Ab及Ab各100μl，放入37℃恒温箱中孵育30min。（如图1）4.洗涤：同上5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置约5-15min，密切观察。6.终止反应酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体待测酶标原液1：51：251：125阴性对照1：251：501：1001：200（图1）选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体稀释方法：1.酶标抗体1:25——1200ul(牛奶）+50ul（酶标）=1250ul1:50——600ul(牛奶）+600=1200ul1:100——600ul(牛奶）+600=1200ul1:200——600ul(牛奶）+600=1200ul酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体2.待测抗体1:5——600ul(牛奶)+150ul(待测)=750ul1:25——600ul(牛奶)+150ul=750ul1:125——600ul(牛奶)+150ul=750ul酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体（二）酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体正式实验选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：1.包被2.洗涤3.加样(如图2)4.洗涤5.显色6.判断检出率酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体自己的待测Ab100ul+酶标Ab100ul别组的待测Ab100ul+酶标Ab100ul稀释液100ul+酶标Ab100ul阳性对照待测1待测2待测3待测4阴性对照图(2)经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色更接近于阳性对照,则记为“+”，反之则记为“-”。结果讨论（一）实验结果阴阳结果讨论以酶标抗体1：100稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测1“+”,待测2“+”,待测3“+”,待测4“+”;4组待测抗体均被成功检出，检出率100%。结果讨论（二）实验讨论伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒O抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。ELISA法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达到70%结果讨论以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早起诊断以ELISA法检测血液中伤寒特异性或抗体为依据。