锌指蛋白的设计与利用

锌指蛋白的设计与利用生物技术三班蒋新培邮箱:[e-mail]摘要：人工设计的锌指蛋白一般包括两个结构域：DNA结合结构域和效应结构域。DNA结合结构域主要采用对DNA序列特异识别]结合的C2H2型锌指结构域，而功能结构域常常采用某些转录激活结构域、转录抑制结构域或某些酶的活性结构域。这样进行设计的锌指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相应的功能，这对于目的基因的表达调控及蛋白质与核酸的相互作用研究提供了新的思路。主要内容锌指结构锌指的设计筛选多锌指之间连接区的设计人工锌指蛋白的应用展望锌指结构•具有重复结构的氨基酸模式，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。•相隔特定距离的半胱氨酸结合锌指，能与某些RNA/DNA结合。锌指结构在1989年Lee等揭示锌指立体结构具有保守型，每个锌指均是由1对反平行的β折叠和一个α螺旋组成，每一个锌指结构都形成独立的包含锌原子的小结构域,它通过2个保守的His和2个Cys螯合一个锌因子,从而使结构更加稳定。锌指结构的共同特征是通过肽链中氨基酸残基的特征集团与Zn2+的结合来稳定一种很短的，可自我折叠成“手指”形状的的多肽空间构型。锌指蛋白•2－13个手指，各由23氨基酸组成，并由7－8个氨基酸连接；与DNA大沟结合并环绕DNA分子，大沟与特异DNA碱基互作。•锌指蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白。锌指的设计筛选在锌指结构中，只有α-螺旋中的几个氨基酸残基对DNA的特异性识别有作用。因此通过构建锌指的噬菌体展示库，从中可筛选与特定DNA序列有高特异性与高度和力的锌指。Rebar和Choo就分别建立了鼠转录因子Zif268的第二个锌指结构中α-螺旋残基的随机肽展示库[4，5]。，用随机三联体碱基进行三轮筛选，得到了与不同三连体碱基对相应结合的64个锌指序列，结果发现：α-螺旋的三个主要位（-1、+3、+6位）和一个辅助位+2位与DNA的识别密切相关。Zif268Zif268是Milbrandt及Lim等分别于1987年克隆发现的.其包括一内含子序列和两个外显子序列，基因全长为3.8kb.Zif268编码一分子质量为61ku的蛋白质Zif268.锌指的设计筛选Isalan等又建立起一种非常快速和简便的方法称之为两部分法。以Zif268的三个锌指为基本框架，把三个锌指拆分成两部分，建立了两个噬菌体展示库。从两个库中筛选出对HIV-1的-80位到+60位启动子序列特异性特别的7个三锌指，并据此设计了7个三锌指肽，研究表明，这7个锌指肽与对应的DNA序列有很好的亲和力与特异性。该方法充分考虑到第二个锌指的α-螺旋的第2位氨基酸残基与第一个锌指α-螺旋的第6位对DNA的识别有协同作用。多锌指之间连接区的设计（1）采用具有柔韧性的连接区，使锌指对所结合DNA亲和力与特异性有所提高。（2）把天然转录因子的二聚化区域作为连接区。总之设计多锌指蛋白时应考虑到锌指之间的连接区，这对于锌指蛋白对所结合DNA特异性与亲和力是重要的。人工锌指蛋白的应用•（1）人工设计的转录抑制•（2）转录激活子•（3）人工限制性内切酶人工设计的转录抑制子人工设计的锌指蛋白可以通过以下方式抑制基因的转录：（1）特异性的锌指与转录抑制结构域相连形成的融合蛋白。（2）设计靶向转录区域的锌指蛋白，抑制转录的延伸；人工设计的转录抑制子（3）设计靶向转录起始区的人工锌指蛋白，阻断或抑制转录起始复合物的装配；（4）靶向目的基因转录增强子结合的区域设计的锌指蛋白，从而抑制基因的转录。人工转录激活子主要通过以下两种方式实现：（1）锌指与转录激活结构域连接形成融合蛋白，通过促进转录复合物的装配激活基因的转录。（2）通过与转录抑制子对基因上游结合的竞争，从而激活基因的转录。人工限制性内切酶把多个锌指与限制性内切酶的切割结构域相连，可以设计人工限制限制性内切酶，研究表明构建人工限制性酶用以切开特定序列DNA双链是可行的。展望•C2H2型锌指为DNA序列特异性锌指蛋白的设计提供了一个很好的框架，通过噬菌体展示技术和计算机结构模式以及锌指连接区的设计可筛选设计出于任意DNA序列特异性结合的锌指，若连上功能结构域可作为基因的转录激因子或转录抑制因子或作用于DNA的酶。