色谱分析方法导论

15.1概述化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！20世纪中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。历史：1903年，俄国植物学家MikhailTswett最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱(希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write)。50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展；复杂组分分析发展的要求。1937-1972年，15年中有12个Nobel奖是有关色谱研究的！色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。色谱分类方法：1.按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱。2.按组份在固定相上的分离机理分：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。3.按两相状态分分类方法固定相平衡类型气液色谱液体吸附于固体气液间分配气固色谱固体吸附剂吸附气相色谱气相键合色谱有机组份键合于固体表面液体和键合体表面间的分配液液色谱液体吸附于固体不相溶液体间的分配液固(吸附)色谱固体吸附剂吸附液相键合色谱有机组份键合于固体表面液体和键合体表面间的分配离子交换色谱离子交换树脂离子交换液相色谱凝胶渗透(尺寸排阻)色谱液体附于多孔聚合物分配/筛析超临界流体有机组份键合于固体表面超临界流体和键合相间分配15.2色谱流出曲线（色谱图）混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应色谱术语：1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大的、稳定的基线为水平直线。2）峰高：色谱峰顶点与基线的距离。u0tLu死时间柱长3）保留值(Retentionvalue,R)a.死时间(Deadtime,t0)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据t0可求出流动相平均流速b.保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。c.调整保留时间：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。d.死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：其中，Fco为柱出口的载气流速（mL/min)，其值为：F0-检测器出口流速；Tr-室温；Tc-柱温；p0-大气压；pw-室温时水蒸汽压。'rt0r'rtttco00FtV0w0rc0copppTTFFe.保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。f.调整保留体积：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。g.相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰i对标准峰的相对保留值，此时以表示：1,又称选择因子(Selectivityfactor)。cor0FtV'rVco'r0r'rFtVVV'1r'2r'1r'2r1,2VVttr)s(t)i(t's'rh.区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：标准偏差：0.607倍峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。15.3色谱法基本原理两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。一、描述分配过程的参数1.分配系数(Distributionconstant,K)：描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。msccK溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度2.分配比(Retentionfactororcapacityfactor,k)：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。其中VmV0，Vs为固定相体积。分配比k的求算：1）组分滞留因子：2）又，3）因此，mmssmsVcVcmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量k11mmmuuRsmmss流动相线速度组分线速度0rstLu，tLu0'r0'r00r0rVVtttttk)k1(tt或3.K与k的关系：称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=6~35；对毛细管柱，=60~600。4.选择因子：色谱柱对A、B两组分的选择因子定义如下：A为先流出的组分，B为后流出的组分。注意：K或k反映的是某一组分在两相间的分配；而是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k相同时，=1时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，越大，分离得越好。也就是说，两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。和k是计算色谱柱分离效能的重要参数！kVVkV/mV/mccKsmmmssmsABAB'r'rKKkk)A(t)B(t二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1.塔板理论（Platetheory)1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n50时，峰形接近正态分布。根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。若柱长为L，则每块理论塔板高度H为由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff和有效塔板高度Heff表示：2r22/1r)Wt(16)Wt(54.5nnLHeffeff2'r22/1'reffnLH)Wt(16)Wt(54.5n有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。但该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：峰形为什么会扩张？影响柱效的动力学因素是什么？2.速率理论（Ratetheory）1956年，荷兰化学工程师vanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了vanDeemter方程：u为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—分别表示涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。CuuBAH1）涡流扩散项(Multipathterm,A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽。展宽程度以A表示：A=2dp其中dp—填充物平均直径；—填充不规则因子。可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。流动方向2）分子扩散项(Longitudinaldiffusionterm,B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2D—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D—组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；讨论：分子量大的组分，Dg小，即B小Dg随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；流动相分子量大，Dg小，即B小；u增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）对于液相色谱，因Dm较小，B项可勿略。)M/1D(g流动相因为球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。3）传质阻力项(Mass-transferterm,Cu)因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。a）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cs和液相传质阻力系数Cl。]Dd)k1(k32[]Dd)k1(k01.0[CCCl2f2g2p22lg流动相固液界面固定液组分分子ClCg讨论：减小填充颗粒直径dp；采用分子量小的流动相，使Dg增加；减小液膜厚度df，Cl下降。但此时k又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。增加柱温，可增加Dl，但k值也减小，为保持合适Cl值，应控制柱温。b）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。讨论：流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力Cs。分别与填充物大小dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子k和扩散系数Ds等有关。因此，