第九章 分子标记

Chapter9MolecularMarker分子标记概念的界定广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本章中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。•分子标记--能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面越来越成为有用的工具。•基本前提:个体间存在的自然遗传变异，进而造成许多遗传序列的多态性，即这些序列在不同的个体表现不同。理想的分子标记的界定理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。分子标记技术的分类第一类：以分子杂交为核心的分子标记技术第二类：以聚合酶链式反应为核心的分子标记技术第三类：新型的分子标记技术第一节以分子杂交为核心的分子标记技术(一)DNA指纹技术（DNAFingerprinting）(二)原位杂交（insituhybridization）Southern印迹在20世纪60年代，Southern首先发现卫星DNA由很多短的重复片段串联在一起。与此同时，HamSimth发现的Ⅱ型核酸内切酶。southern纯化EcoRⅡ。Southern用EcoRⅡ酶切卫星DNA，电泳后凝胶中出现了梯状条带（ladder）。他将5SrRNA基因组DNA通过一种或几种限制酶消化后，通过琼脂糖电泳按照大小分离，然后将DNA经过原位变性后，转移到硝酸纤维膜上，再与有放射性标记的5SrRNA杂交，通过放射性自显影确定了5SRNA基因在基因组上的位置。1987年用southernblotting方法发现，在美国黑人中，导致镰刀型红细胞贫血症的β－球蛋白突变，在其基因在酶切位点附近有多态性，该发现使得可以使用southernblotting检测DNA来直接地跟踪疾病相关基因。——限制片断长度多态性（RFLP）随着人类基因组计划的开展，southern开发出了寡核苷酸微阵列（oligonuleotidearrays）RFLP，Oligonuleotidearrays1984年9月11日，英国科学家亚历克·杰夫里斯和同事在研究基因变异时，偶然发现基因中存在一些足以区分生物个体的微小结构，并于当天绘制出了世界上第一幅“DNA指纹”，他们此后将这些结构称为“随体”。DNA指纹技术(一)DNA指纹技术（DNAFingerprinting）--用限制性内切酶消化基因组DNA,并用特异性核酸探针杂交，取得不同大小的DNA片段的区带图谱,该图谱具有高度的个体特异性，类似于人的指纹。类型限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）数目可变的串联重复多态性（Variblenumberoftandemrepeats，VNTR)限制性片段长度多态性标记(Restrictonfragmentlengthpolymorphism,RFLP)RFLP—特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全水解后，产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一般DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。1974,Grodzicker,etal.found.基本步骤DNA提取DNA限制性内切酶消化凝胶电泳分离限制性片段将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（Southernblot）放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性RFLP标记的主要特点遍布于整个基因组，数量几乎是无限的;无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；结果稳定、可靠；DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。1980年Wyman等发现了在未知的物理图谱位置存在高度可变的多等位基因位点。Jeffreys在分析球蛋白基因家族的myoglobin时发现在其基因内部有一个小卫星DNA序列，并且它们的重复特征和其他基因中发现的序列具有相似性。然后Jeffreys用这些发现的小卫星序列来筛选人类基因组文库，分离得到了其它的一些可变基因座。测序后发现：这些小卫星序列共有一个10-15bp的基序（motif）。Jeffreys又利用southernblotting的方法将这些小卫星序列和来自不同物种的基因组DNA片断进行杂交，发现甚至在一个家庭中这些DNA的特征也是高度可变的。VNTR’s和DNA指纹数目可变的串联重复多态性（Variblenumberoftandemrepeats，VNTR）VNTR—一类叫小卫星DNA（minisatelliteDNA），其核心序列长11～16bp，多存在于异染色质区域（如端粒、随体、基因非编码区）；另一类叫微小卫星DNA或微卫星DNA（microsatelliteDNA），其核心序列长仅2～5bp，故亦称为STR（短串联重复，shorttandemrepeat），广泛分布于基因组中。凡是核心序列相同的VNTR属于一种VNTR，尽管它们的长度、重复次数和分布位点可能不一样。英国的遗传学家AlecJeffreys在进行肌红蛋白的DNA序列研究时，意外发现非功能DNA（不产生蛋白的DNA）上重复着一种小片段DNA，这一含15个左右碱基的DNA片段，在不同个体间重复的频率及位置有明显的不同VNTR的主要特点在人群中呈现出高度的多态性，即不同的人，同一种VNTR在染色体上的分布、数目和长度不尽相同。对于每一个个体来说，其VNTR的组成与分布却相对稳定（无论是在体细胞还是在生殖细胞中）。呈孟德尔共显性遗传。DNA指纹技术的应用亲子鉴定（VNTR）犯罪分析•血液、唾液、头发、精液和其他出现在犯罪现场的样品成为嫌疑犯被监禁或释放强有力的证据•误差率在百万分之一以下，结果非常精确。DNA身份证DNA指纹技术让你能拥有一张独一无二的真正意义上的个人识别身份证。个人DNA基因身份证southernblotting和DNA指纹技术的发明者（EdwinSouthern和AlecJJeffreys）在2005年因其发现的重要意义获得了有医学诺贝尔奖之称的lasker奖。（二）染色体原位杂交（insituhybrisization）染色体原位杂交技术：DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。荧光素标记的原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization，FISH）：利用与荧光素偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。基本步骤：制备探针—染色体制片—染色体处理与变性—染色体与探针杂交—显微检测。特点：简便，结果直观；灵敏度和分辨率依赖于制片技术和观察设备。用作植物染色体原位杂交的探针因研究目的不同有许多种，主要的有：用于物种起源和亲缘关系研究的物种专化DNA序列或外源物种总基因组DNA；用来构建染色体物理图谱的低拷贝或单拷贝序列；用于转基因植物鉴定的含目的基因的BAC和YAC克隆。荧光原位杂交果蝇唾液染色体第二节以PCR反应为核心的分子标记单引物PCR标记3’端具有选择性的双引物PCR标记基于特异双引物PCR的标记类型•随机扩增多态性DNA标记（RandomamplificationpolymorphismDNA,RAPD标记）•简单序列重复标记（Simplesequencerepeat,SSR标记）—锚定PCR(SSR—anchoredPCR)标记•序列特征化扩增区域（Sequencecharacteredamplifiedregion,SCAR标记）•AP-PCR(ArbitaryPrimedPCR)(引物10～50个碱基)•DAF(DNAAmplificationFingerprinting)（引物短至5bp）•SPARs(SinglePrimerAmplicationReactions)标记单引物PCR标记3’端具有选择性的双引物PCR标记扩展片段长度多态性标记（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP标记）基于特异双引物PCR的标记真核生物基因组中的小卫星和微卫星DNA具有丰富的多态性，依据这些DNA序列设计双引物进行PCR扩增会产生新的遗传标记。例如:AMP-FLPs(Amplified-FragmentLengthPolymorphismsRAPD—用随机引物进行基因组DNA的PCR扩增,电泳分离扩增片段,得到随机扩增的多肽性DNA片段图谱。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。增加或缺少的PCR产物则为RAPD标记。随机扩增多肽性DNA标记(RandomamplificationpolymorphismDNA,RFLP)1990,Williams,etal.found.无需DNA探针，无需知道序列的全部信息；技术简便；DNA样品需要量少，成本低；实验重复性较差，结果可靠性低；存在共迁移问题。RAPD标记的主要特点简单序列重复标记（Simplesequencerepeat,SSR）SSR—根据微卫星DNA两端的保守单拷贝序列设计一对引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术可获得其长度多肽性。1991,Moore,etal.found.微卫星(microsatellite)或简单重复序列(simplesequencerepeats，缩写SSR)，STMS(Sequence-taggedmicrosatellites)，SSRP(SimpleSequenceRepeatPolymorphisms)：重复单位含有1-5个碱基（也有2-8个碱基）组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。1989,Litt&Luty:Microsatellite主要特点广泛分布于整个基因组，数量丰富；具有较多的等位性变异；共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；实验重复性好，结果可靠；由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，可以在其它钟的DNA数据库中查询，否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库，再从中筛选可用的克隆，进行测序，然后设计合适的引物。常用的分子标记特性比较CharactersRFLPRAPDAFLPSSR分布普遍普遍普遍普遍可靠性高中等高高重复性高中等高高遗传性共显性显性显性或共显性共显性多态性中等高非常高高DNA需求2-30ng1-100ng100ng50-100ng放射性一般有无有或无无技术难度中等简单中等简单样品生产率中低高非常高高时间因素长快中等快探针类型低拷贝DNA或cDNA克隆随机序列特异DNA序列特异DNA重复序列探测部分低拷贝编码区域整个基因组整个基因组整个基因组检测位点1-31-1020-1001-5第三节新型的分子标记单核苷酸多