19动物布病诊断技术

新乡市动物疫病预防控制中心刘海林电话：[phone]邮箱：[e-mail]布鲁氏菌病检验方法：依据标准：GB/T18646-2002适用范围本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。本规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。虎红平板凝集试验材料准备抗原、标准阳性血清、阴性血清由指标单位提供，按说明用。受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。准备一块洁净玻璃板，画成若干个4厘米小格或虎红平板凝集试验卡片。吸管或移液器，适于滴加0.03ml（即300μl）液体。牙签或火柴杆供搅拌用。操作方法将玻璃板上各格标记受检血清号(或在布病反映卡上操作)，然后加相应血清0.03ml。图1.在受检血清旁滴加抗原0.03ml。用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。图2每次试验应设阴性、阳性血清对照图1图2结果判定判定结果前最好将抗原与血清混合物摇动几下.如图3.在阴性、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。被检血清在4分钟内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（—）。图4.图5每份被检血清在规定时间内出现凝集反应者判为阳性，不出现凝集为阴性反应。图3阳性阴性图4阴性阳性图5注意事项：本抗原适合于大数量田间检疫和筛选诊断试验用。本试验出现阳性反应的动物，需经补体结合试验或其它辅助试验方可定性。本抗原使用前应充分摇匀，方可使用。凡本抗原出现污染或摇不散的凝集块者不得使用。布鲁氏菌病乳环试管凝集试验布病全乳环状抗原，由指标单位提供，按说明用。乳样受检乳样须为新鲜全乳。采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可适用。需要器具有：水浴锅、100μl移液器、1000μl移液器、小试管、试管架、移液器枪头、乳环抗原等。材料准备：操作方法取乳样1ml，加于灭菌凝集试验管内。取充分震荡混合均匀的全乳环状抗原1滴（约50µl）加入乳样中充分混匀。置37℃～38℃水浴中60min。加热后取出试管勿使震荡，立即进行判定。结果判定强阳性反应（+++），乳柱上层乳脂形成明显红色环带，乳柱白色，临界分明；阳性反应（++），乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色；弱阳性反映（+）乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱上颜色略深；疑似反映（±）乳脂层的环带颜色不明显，于乳柱分界不清，乳柱不褪色；阴性反映（—）乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。乳环试验阳性乳环试验阳性乳环试验阴性，乳汁颜色均匀，未见红色乳环布鲁氏菌病试管凝集试验材料准备稀释液：0.5%石碳酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石碳酸的10%盐溶液。1.2抗原、阳性血清、阴性血清由指标单位提供，按说明书使用。1.3凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱等。3分是英制管道直径长度的叫法，换算成毫米为9.525mm，这里指内径约为10mm试管操作方法1.按常规方法采血分离血清。2.运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送检，按每9ml血清加1ml5%石碳酸生理盐水防腐，也可冷藏方法运送血清。3.被检血清的稀释以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。3.1第1管标记检验编码后加1.15mL稀释液。3.2第2～4管各加入0.5mL稀释液。3.3然后向第1管内加入0.1mL被检血清，并混合均匀。充分混匀后弃去混合液0.25mL。3.4取0.5ml混合液加入第2管，混合均匀。3.5再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5mL。3.6稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100。3.7牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第1管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。3.8将0.5mL稀释好（具体稀释倍数参照试剂生产厂家的要求，一般是1：10）的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：50和1：100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50。布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊、猪）1号管2号管3号管4号管....................n0.5%石炭酸10%盐水1.150.50.50.5....................最后一管弃去0.5ml被检血清或阳阴性血清对照加0.1ml血清，混匀后弃去0.25ml最后体积为1ml0.50.50.5....................试管中加抗原以前液体量0.50.50.50.50.50.5加抗原液（1：10稀释好的）0.50.50.50.50.50.5血清稀释度1:251:501:1001:200....................充分混匀37℃18-24小时温育结果判定++++++++++--吸0.5ml布鲁氏菌病试管凝集反应试验（牛）1234....................n0.5%石炭酸盐水1.20.50.50.5....................最后一管弃去0.5ml被检血清或阳阴性血清对照加0.05ml血清，混匀后弃去0.25ml最后体积为1ml0.50.50.5....................试管中加抗原以前液体量0.50.50.50.50.50.5加抗原液（1：10稀释好的）0.50.50.50.50.50.5血清稀释度1:501:1001:2001:400....................充分混匀37℃18-24小时温育结果判定++++++++++--吸0.5ml3.9每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，a)阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清相同。b)阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与被检血清相同。c)抗原对照：稀释好的抗原液0.5ml,再加0.5ml稀释液，观察抗原是否有自凝现象。3.10将稀释好各管置37℃～40℃温箱24小时，取出检查并记录结果。结果判定1供判定参照比浊管制备方法略2结果判定2.1凝集成度分为：参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读⑴＋＋＋＋菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；⑵＋＋＋菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；⑶＋＋菌体凝集显著，液体50%清亮；⑷＋凝集物有沉淀，液体25%清亮；⑸－凝集物无沉淀，液体均匀混浊。2.2牛、马、鹿、骆驼1：100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1：50血清稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，被检血清判定为阳性。2.3牛、马、鹿、骆驼1：50血清稀释，猪、山羊、绵羊、狗1：25血清稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，被检血清判定为可疑反应。可疑反应家畜经3～4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。试管凝集试验阳性结果（液体上层清亮，底部凝集）试管凝集试验阴性结果（均匀的浑浊液体）试管凝集试验抗原对照（均匀的浑浊液体）