煤附生真菌产漆酶菌株的分离鉴定及产酶特性研究kdh

Mycosystema菌物学报15May2010,29(3):[e-mail]1672-6472CN11-5180Q©2010InstituteofMicrobiology,CAS,allrightsreserved.基金项目：重庆市科委科技攻关资助项目（No.CSTC,2006AC1045）*Correspondingauthor.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]收稿日期:2009-12-01,接受日期:2010-03-16煤附生真菌产漆酶菌株的分离鉴定及产酶特性研究陈今朝1王剑锋2*李江2饶军2秦家顺11长江师范学院生物系涪陵4081002东华理工大学生物系抚州344000摘要：从煤炭样品中筛选到一株产漆酶活性菌株，经菌体形态观察和ITS序列分析，鉴定为TrichodermaasperellumW03。菌株所产漆酶的最适反应pH为3.5－4.5，最适反应温度45℃，类似于白腐真菌漆酶。液态发酵条件的均匀设计实验表明，适宜的发酵培养基组成为：土豆200.00g/L、葡萄糖9.36g/L、米糠粉37.44g/L、硝酸钾4.00g/L、KH2PO43.20g/L、MgSO4·7H2O2.00g/L、CuSO4·5H2O0.005g/L、初始pH8.0；在33℃、180r/min、50mL/250mL的摇瓶培养条件下，棘孢木霉W03在孢子接种培养后48h、84h产酶量较高，分别处在菌体的快速生长期和衰亡期；菌体产酶受Cu2+、联苯胺诱导，而受1-萘酚、愈创木酚和2,4-D抑制。关键词：均匀设计，半知菌，棘孢木霉，ITS序列Identificationandproductionoflaccase-producingfungalstrainisolatedfromcoalCHENJin-Zhao1WANGJian-Feng2*LIJiang2RAOJun2QINJia-Shun11DepartmentofBiology,YangtzeNormalUniversity,Fuling408100,China2DepartmentofBiology,EastChinaInstituteofTechnology,Fuzhou344000,ChinaAbstract:Laccase-producingstrainscreenedfromlow-rankcoalwasidentifiedasTrichodermaasperellumW03accordingtoitsmyceliamorphologyandITSsequenceanalysis.ThelaccasehasanoptimumpHof3.5－4.5andanoptimumtemperatureof45℃,whichissimilartothatfromwhiterotfungi.Componentsoflaccase-producingmedium(g/L)optimizedbyuniformdesignwere200.00g/Lpotato,9.36g/Lglucose,37.44g/Lricebranpowder,4.00g/LKNO3,3.20g/LKH2PO4,2.00g/LMgSO4·7H2Oand0.005g/LCuSO4·5H2O.Thepeakoflaccaseproductionappearedinthe48hand84hcorrespondingtothelogarithmicphaseanddeclinephase,respectively,whenTrichodermaasperellumW03wassubmergedinshaking-flaskwithliquidvolume50mL/250mLunderconstanttemperatureof33℃andvibrationof180r/min.ThelaccaseproductioninTrichodermaasperellumW03wassignificantlyimprovedbyadditionofsomesubstancesuchaspotatoextract,ricebran,Cu2+orbenzidineinthemedium,but390Mycosystema:uniformdesign,deuteromycetes,Trichodermaasperellum,ITSsequence木质素降解酶类包括木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶（LaccaseEC1.10.3.2，对苯二酚:氧氧化还原酶）等，在催化木质素的降解过程中只有漆酶不需要过氧化氢（Have&Teunissen2001），并且能够催化多种有机物特别是多环芳烃类发生氧化降解、聚合等反应，同时将氧气还原为水；漆酶广泛参与了菌体色素合成、孢子产生、子实体发育（Langfelderetal.2003）、逆境防御和腐殖质形成（Burke&Cairney2002）等多种生物学过程；在生物学基础理论和环境修复、生物制浆与漂白、绿色有机合成、食品加工等应用领域具有广泛的研究利用价值。微生物溶煤是利用低阶煤炭资源生产精细化学品的新兴绿色工艺，已经证实多种微生物参与煤炭的生物转化，其中微生物漆酶在整个转化过程中发挥着重要作用（陶秀祥等2005），因而，煤炭样品可能是产漆酶菌株的重要来源。因此，文中对不同来源的煤炭样品进行了漆酶产生菌株的筛选和鉴定，实验分析了菌株产酶条件和部分酶学性质，为进一步研究利用菌株的溶煤功能奠定实验基础。1材料与方法1.1菌种实验菌株分离筛选自贵州遵义煤矿煤样。1.2培养基菌种保藏及种子培养基：PDA；漆酶筛选培养基：愈创木酚（0.04%）PDA（GPDA）培养基，α-萘酚（0.04%）PDA（NPDA）培养基（王剑锋等2007）；察氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO32.0g，KH2PO41.0g，KCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，水1,000mL，pH自然。1.3菌株的分离筛选与培养1.3.1产酶菌株的分离筛选：取少量煤样粉末撒布于GPDA平板表面，置30℃培养观察，菌落周围呈红褐色者为产酶阳性菌落，切取阳性菌落边缘菌丝移种于NPDA平板纯化，其中菌落周围呈蓝色者为产漆酶菌株。1.3.2产酶菌株的液体培养：将从PDA平板表面刮取的孢子用无菌玻璃珠打散、无菌水稀释至107个/mL，接种于装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于33℃、180r/min震荡培养，每种培养条件进行3次平行重复。1.4菌种鉴定1.4.1形态学观察：菌体孢子梯度稀释接种于涂有PDA的载玻片，30℃培养观察菌落、菌体特征。1.4.2ITS序列扩增与分析：菌株孢子接种于PD培养基，28℃振荡培养24h，离心收集菌丝，按氯化苄法（朱衡等1994）提取菌体总DNA；以菌体总DNA为模板，利用一对rDNA-ITS通用引物（ITS-1、ITS-4）进行PCR扩增，扩增产物纯化后，送样测定DNA序列，将测序获得的ITS序列通过与GenBank中的核酸数据库序列进行Blastn分析。ITS-1：5′-GTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；PCR反应程序：预变性95℃5min，变性95℃1min，复性50℃1min，延伸72℃1min，35个循环，最终72℃延伸10min。引物合成、序列测定均由上海生工生物工程有限公司完成。1.5漆酶活力测定以愈创木酚为漆酶底物，按照王剑锋等（2009）的方法进行测定，一个酶活单位（U）定义为1min内氧化1µmol愈创木酚所需要的酶量。1.6漆酶的初步纯化经尼龙丝网过滤的发酵液在4℃下10,000r/min离心5min；上清液经超滤（截留分子量5,000）浓缩至1/10体积得酶液。1.7漆酶的部分酶学性质1.7.1酶促反应最适温度及最适pH：在不同温度（pH）下按标准方法测定漆酶活力，以酶活力最大时的反应温度（pH）为酶活的最适温度（pH）。1.7.2酶的热稳定性及pH稳定性：酶液分别在45℃、50℃下pH4.0的缓冲液中保温不同时间，按Vol.29No.3391菌物学报标准方法测定相同条件下漆酶活力，以未保温酶液的酶活为100%，测定相应温度下酶活的半衰期；酶液在不同pH的缓冲液中25℃保温12h，按标准方法测定残余酶活，以未保温酶液的酶活为100%。1.8数据分析采用统计软件DPSv3.01专业版。2结果与分析2.1产酶菌株的筛选利用不同来源的煤炭样品进行产漆酶菌株筛选，只从贵州遵义的煤样中获得了3株菌落特征相似的产漆酶菌株（图1），分别记为W01、W02、W03；在菌落对峙平板上，3株菌的菌落之间有明显的拮抗线，说明3个菌株之间存在种属差异；依据摇瓶复筛结果，确定产酶量较高的菌株W03为实验菌株。图1筛选平板上的产漆酶菌落Fig.1Colonyoflaccase-producingstrainonscreeningplate.2.2产酶菌株W03的鉴定2.2.1菌株W03的菌体形态特征：菌株W03孢子接种PDA平板30℃培养12h，菌落直径即可达到约6mm，生长初期菌丝（图2）密集平伏于培养基表面，白色，后期产孢子由中心至边缘逐渐形成浅绿到深绿色同心环，无气味，菌落背面不变色，未见黄色色素；分生孢子梗（图2）中间宽3.0－4.0µm，呈树状分枝，分枝对生呈直角伸出，顶端有两个或3个一组轮生的安瓿状短细瓶梗，底部瓶梗较顶部长；分生孢子（图2）球形或近卵形，淡绿色，直径3－5µm，壁上见细刺状突起。依据实验菌株形态及培养特征与棘孢木霉Trichodermaasperellum的形态描述极为相似（章初龙和徐同2005），实验菌株W03初步鉴定为棘孢木霉Trichodermaasperellum。2.2.2菌株W03的rDNA-ITS序列分析：以提取的菌株W03总DNA为模板、ITS-1-ITS-4为引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长约600bp；测序结果表明，菌株W03的ITS序列长度为567bp，GC含量为55.03%，将该序列在GenBank中进行BLAST同源性比较，发现与GenBank报道的6株棘孢木霉Trichodermaasperellum（登录号：FJ797513、FJ412054、FJ412053、FJ004799、EU280132和EU280109）的ITS序列的同源性达到100%。结合菌株W03的形态特征和rDNA-ITS序列分析结果，菌株W03初步鉴定为棘孢木霉TrichodermaasperellumW03。2.3TrichodermaasperellumW03产漆酶的条件2.3.1基础产酶培养基的选择及T.asperellumW03的产酶曲线：以察氏培养基为基础培养基考察了土豆汁（20%）、米糠水解液（1%）对菌株W03产漆酶的影响，结果显示，土豆汁、米糠水解液均能显著促进菌株产酶，以土豆汁20%效果最佳（表1），因此，添加了土豆汁20%的察氏培养基作为基础产图2菌株W03显微形态A：菌丝（40×10）；B：分生孢子梗（10×10）；C：分生孢子（40×10）.Fig.2MorphologyofmyceliaandsporesofthestrainW03culturedonPDA.A:Mycelia(40×10);B:Conidiophoresandphialides(10×10);C:Conidia(40×10).392Mycosystema