第三章 基因工程制药

第三章基因工程制药第一节、基因工程制药概述第二节、基因工程制药基本技术与策略第三节、基因工程制药生产的基本步骤第四节、基因工程制药的具体实例第一节基因工程制药概述一、基因工程制药的概念二、基因工程技术所生产的药物三、基因工程制药的优点四、基因工程制药所使用的生物技术五、我国基因工程制药的进展六、基因工程制药生产的基本步骤七、基因工程制药生产的化学工艺学要求八、基因工程的发展一、基因工程制药是指在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物的工艺过程。二、基因工程技术所生产的药物主要是药用活性蛋白质和多肽类，具体包括：（1）免疫蛋白质----各种抗原、单克隆抗体、乙肝疫苗。（2）细胞因子----各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子、促红细胞生成素。（3）激素----胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。（4）酶类----尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、超氧化物歧化酶、α-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。三、基因工程制药的优点（1）可以生产出过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以通过大批量的生产方法获得足够数量的生物活性物质。（3）可以发掘出更多的内源性生理活性物质。（4）利用基因工程技术和蛋白质工程技术可以对药物蛋白进行修饰和改造，来提高药效价值，或者获得新型的化合物。（5）为制药工业提供新技术，为新药研发提供了新途径和新技术，提高药物研发的速度四、基因工程制药所使用的生物技术（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术基因工程制药的基本技术（1）根据DNA分子复制与稳定遗传的原理，利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平。（2）根据基因表达的分子生物学原理，筛选、修饰和重组启动子、增强子、操纵子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平基因工程制药的基本技术（3）根据分子生物学原理，选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的合成过程。（4）根据生化工程学原理，从基因工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理调控其增值速度和最终数量，这也是提高外源基因表达产物产量的主要环节。五、我国基因工程制药的进展α-1b型基因工程干扰素，是我国自行研究开发的具有国际先进水平的基因工程药物，于1997年通过III期临床，并获得国家一类新药证书。它源于中国人基因，最适于黄种人使用。六、基因工程制药生产的基本步骤1、流程图2、上游阶段3、下游阶段1、流程图•获得目的基因↓构建重组质粒↓组建基因工程菌或者基因工程细胞↓培养工程菌↓产物分离纯化↓除菌过滤↓半成品检定↓成品检定↓包装2、上游阶段主要是分离目的基因和构建工程菌细胞，其工作主要是在实验室内完成。具体内容包括：（1）获得目的基因（2）构建基因克隆载体和基因表达载体（3）将重组后的基因转移到大肠杆菌或者其它宿主细胞内3、下游阶段•是指从工程菌的大规模培养，一直到产品的分离纯化，其工作主要是将实验室成果产业化、商品化。其工作重点是：（1）必须保证所表达的蛋白质具有生物活性（2）考虑基因工程蛋白质表达量的多少（3）蛋白质分离纯化的难易程度七、基因工程制药生产的化学工艺学要求（1）工程菌大规模发酵工艺最佳参数的确立（2）新型生物反应器的研制（3）高效分离介质和装置的开发（4）分离纯化技术的优化控制（5）高纯度产品的制备技术（6）生物传感器等仪器仪表的设计和制造（7）电子计算机的智能优化控制八、基因工程的发展（一）基因工程的历史（二）基因工程所生产的产品（三）基因工程的发展方向（一）基因工程的历史•1973年----Cohen第一例成功的克隆实验。•1978年----Genentech公司生产出世界上第一种基因工程蛋白药物----人胰岛素。•1982年----第一个基因工程药物重组人胰岛素在英、美获准使用。•八十年代中期----PCR技术发明•1985年----第一批转基因家畜（兔、猪和羊）培育成功。•1999年9月----中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%•2000年6月26日----科学家公布人类基因组工作草图。•2001年2月11日----公布人类基因组基本信息。（二）基因工程所生产的产品胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体（三）基因工程的发展方向第一代基因工程----蛋白多肽的高效表达----经典基因工程第二代基因工程----蛋白编码基因的定向诱变----改造基因第三代基因工程----代谢信息途径的修饰重构----改造个体第四代基因工程----基因组或染色体的转移----基因组工程基因工程制药的发展经历了3个阶段1.细菌基因工程：真核目的基因难以表达2.细胞基因工程：哺乳动物细胞培养条件复杂，产量低，成本高3.转基因动、植物生产药用蛋白：生物反应器固有的优越性而成为最有发展前景的基因工程药物生产技术第二节、基因工程基本技术与策略一、酶切与连接（一）定义--限制性内切酶切及与载体连接（二）关键问题--限制性内切酶的选择及连接末端的设计。（三）具体方法：1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接2、同尾酶产生的粘性末端连接3、不同限制性内切酶粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接--5’突出末端5、人工粘性末端的连接--3’突出末端6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接2、同尾酶产生的粘性末端连接3、不同限制性内切酶粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接--5’突出末端5、人工粘性末端的连接--3’突出末端6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点•利用PCR扩增基因时，在引物序列中加入特定的限制性酶切位点序列，在扩增基因的两侧就带有了该特定酶切位点。•例如基因工程目标是克隆Cln3基因，并插入特定载体4、利用中间载体提供酶切位点例：Taq酶特点，常会在3’末端添加一个脱氧腺苷酸（A），因此，为克隆PCR产物，设计一个特殊的载体--T载体，其特点是3’末端含有一个脱氧胸腺苷酸（T）。PCR产物可以不经过酶切直接与T载体连接，即T/A克隆1、大肠杆菌的质粒转化（1）钙离子转化法（2）电转化法（3）大肠杆菌的噬菌体转染二、转化（1）钙离子转化法适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），利用钙离子与细菌细胞膜磷脂在低温下形成液晶结构，这一状态下的细胞称为感受态细胞。此时细胞经过热脉冲发生收缩作用，细胞膜出现间隙，此时质粒DNA可通过进入细胞。（2）电转化法在瞬间强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大（3）大肠杆菌的噬菌体转染2、酵母的质粒转化方法（1）乙酸锂转化法（2）原生质体转化法（3）电转化法三、影响转化率的因素1、载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。2、载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率要比新制备的质粒低两个数量级。3、插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低4、受体细胞的性质：不同菌株转化效率有较大差异5、受体细胞与载体的匹配：受体细胞必须与载体相匹配，如：pBR322转化大肠杆菌JM83株转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。6、实验参数条件方面：实验操作对转化率影响较大，特别是电转化，转化电压，电容，电阻等参数的设置非常重要。四、重组克隆的检测1、抗药性检测筛选法2、显色检测3、限制酶切图谱检测4、PCR扩增检测5、原位杂交检测6、外源蛋白质功能检测1、抗药性检测筛选法3、限制酶切图谱检测限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子，是基因克隆最常用的检测方法。6、外源蛋白质检测利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质，检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体的检测。第三节、基因工程制药生产的基本步骤一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、阳性克隆的筛选鉴定技术七、重组基因的序列分析八、重组基因表达过程的调控-高产工程菌株九、工程细胞的扩增和发酵生产十、基因工程菌的稳定性及其生长代谢特点十一、基因工程药物的分离和纯化技术十二、基因工程药物的质量控制一、工具酶的分离纯化（从公司购买）（一）基因工程制药所用到的工具酶（二）关于限制性内切酶（三）关于连接酶（一）基因工程制药所用到的工具酶•限制性内切酶甲基化酶•Klenow聚合酶T4-DNA聚合酶•T4-多核苷酸激酶碱性磷酸酶•核酸酶-S1核酸酶-Bal31•绿豆核酸酶核糖核酸酶•人外切核酸酶DNA酶Ⅰ•外切RNA酶-III外切RNA酶-VI•polyA聚合酶T4-DNA连接酶•末端脱氧核苷酸转移酶T4-RNA转移酶•逆转录酶（二）关于限制性内切酶1、宿主限制现象2、限制酶的定义3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制性内切酶6、影响限制性内切酶作用的因素1、宿主限制现象•当一种病毒自宿主A分离之后，去感染宿主B的感染率只有万分之一。若将宿主B中的病毒再度分离出来，重新感染B，其感染率为100%，如再去感染宿主A，其感染率又只有万分之一。•产生这种现象的原因是由于宿主细胞中存在着限制酶与修饰酶。它们对于DNA具有识别作用。（1）外源性DNA进入宿主体内后，通常被限制酶所降解，而不能表达。（2）修饰酶又称甲基化酶，通常只修饰自身体内的DNA、使其不被限制酶所降解。有时候，修饰酶会误将外源性DNA当作自身体内的DNA，而进行修饰，这就是病毒在不同宿主之间有万分之一感染率的原因。•限制酶和修饰酶一起构成了限制---修饰系统，它们是物种遗传稳定中进行自我防卫的组成体系。2、限制性内切酶的定义•凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制性内切酶。分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶-----是单一的多功能酶，由于其切割产生的DNA片段5-末端不能作为多核苷酸激酶磷酸化的底物，因此不能作为基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型限制酶-----只具有限制作用，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----功能尚有待于进一步研究。4、限制性内切酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）进行DNA分子间的杂交。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。（6）进行DNA碱基甲基化识别。5、基因工程所用到的REEcok-IHind-IIIBamH-IPst-ISst-ISal-IAva-IBcl-IHind-IIHpa-IBgl-IICla-IHae-IIIHha-IHinf-IHpa-IIMbo-ISma-IXba-IXha-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度----最适温度（5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、BSA、它们具有激活酶、稳定酶的作用。线性DNA连接前的末端去磷酸化Alkalinephosphotase虾来源的酶(SAP)、大肠杆菌来源的酶(BAP)