Annexin-V-APC和7-AAD双染色检测细胞凋亡

1细胞功能实验—AnnexinV-APC/7-AAD双染色检测细胞凋亡1.材料1.1.实验材料试剂/材料来源Cat.No.血清biowestS1810双抗HycloneSV30010胰蛋白酶(不含EDTA)HycloneSV30037.01无水乙醇国药集团化学试剂有限公司10009269AnnexinV/7-AADdoublestainingkit南京凯基公司KGA1026所用基础培养基请根据所培养细胞需求确定。1.2.试剂配制1.2.1培养基配制于基础培养基中，加入10%FBS，1%双抗，以及其他营养成分（个别细胞需要额外的营养因子，请参考细胞需求），轻轻混匀，4℃冰箱储存（以下简称培养基）。1.2.275%乙醇配制取75ml无水乙醇，加入25ml超纯水，混匀。1.2.3PI染液配制（根据试剂盒说明书配制）试剂1个样品6个样品12个样品染色缓冲液0.5mL3mL6mLPI染液（20×）25μL150μL300μLRNaseA（50×）10μL60μL120μLFinalvolume0.535mL3.21mL6.42mL混匀后置于冰上备用。1.3.主要仪器仪器来源Cat.No.二氧化碳培养箱Thermo311显微镜OlympusCKX41生物安全柜苏净安泰BSC-B000IIA2离心机上海卢湘仪公司TP25-ws2酶标仪Epoch波长595nm2.实验步骤（根据试剂盒说明书操作）1.用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm，3min离心，吸去上清，用PBS洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。2.取1E+5个细胞量的悬液，离心弃上清，加入500μlBindingbuffer重悬细胞。3.加入5μLAnnexinV-APC，混匀后，再加入5μL7-AAD染液，混匀，室温，避光，反应5-15min后置于冰上。4.1小时内进行流式细胞仪机检测。5.GFP的绿色荧光：FITC通道筛选GFP阳性细胞进行AnnexinV-APC／7-AAD荧光检测。6.AnnexinV-APC的红色荧光：激发波长633nm，最大发射波长660nm。7.7-AAD红色荧光：激发波长Ex=546nm；发射波长Em=647nm。