实验一 鸡新城疫疫苗(一)

实验一鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术（一）新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖，收获的鸡胚尿囊液中即含有新城疫活病毒，将收获的尿囊液经过灭活，并加入佐剂，便制成了新城疫灭活疫苗。目的和要求：1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接种方法；2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。实验材料：白壳鸡胚、孵化箱、１mL注射器、蛋托、新城疫Ⅳ系弱毒苗、注射用生理盐水、青霉素、链霉素等实验内容：1.鸡胚的选择和孵化：孵育前的鸡胚先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度45%～60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1～2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。2.接种材料的制备：将青霉素和链霉素分别注入注射用生理盐水瓶中，使两种抗生素在生理盐水中的含量均达到1000-2000IU(μg)/ml。将注射用生理盐水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀释。3.照蛋定位：接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室位置，再于胚胎侧画出接种位点（进针点），接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚头约1cm左右。4.病料接种：若用鸡胚分离、培养病毒，则应选9～12日龄之间的发育鸡胚。许多病毒，特别是大多数禽病毒都能在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然后严格消毒接种部位和气室（先用碘酊消毒，再用70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接种处理好的接种材料0.2mL。接种后要用石蜡将孔口封死，放37℃环境中继续孵育96h。不同病毒其接种部位、方法和培养时间不尽一样。（1）尿囊腔接种这是最常用的接种方法，鸡新城疫、减蛋综合征病毒、传染性支气管炎病毒、法氏囊病毒等均可采用这种方法。蛋壳消毒后，先在气室上打一小孔，再于胚胎一侧靠近气室处所画位点打一小孔，用带5～7号针头的注射器插入孔内约1.5cm，接种材料0.2mL。进针时针头与蛋壳应保持30℃角，不应垂直进针，注射完毕，立即用溶化的热石蜡将注射口和气室上小孔密封，然后放回37℃孵化箱孵化96h。并保证气室朝上。（2）绒毛尿囊膜接种该方法主要用于痘病毒、喉气管炎病毒和马立克氏病毒等的分离培养。将卵壳消毒后，先在气室上打一小孔，再于胚胎侧靠近气室处避开大血管用钢锯条将蛋壳打开一个4ｍm见方的小口，用刀尖小心撬开蛋壳，不能损伤卵壳膜，形成卵窗。用针尖轻轻挑破卵窗中心的卵壳膜，但不能损伤卵壳膜下的绒毛尿囊膜。在针尖挑破处滴一滴灭菌生理盐水或甘油，然后用吸头在气室小孔上吸气，使胚内造成负压，这时卵窗处绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见生理盐水或甘油迅速渗入。用注射器滴加2～3滴接种物于卵窗的绒毛尿囊膜上，以透明胶纸封住卵窗。气室小孔用石腊密封，接种后的鸡胚平放在孵化箱中，卵窗向上，不要转动。（3）卵黄囊接种此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用带7号针头的注射器垂直刺入约3cm，注射接种物0.1～0.2mL。石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次。6.接种后的孵化和观察接种后继续在37℃孵化，每天照蛋2次，死胚随时取出。一般24h内死亡的胚多因创伤或细菌污染所致，故弃去不用。24h以后死亡的胚，取出后放4℃冰箱，并作上记号。接种后的孵化时间长短随病毒种类不同而不同，一般新城疫病毒、支气管炎病毒、减蛋综合征病毒和法氏囊病毒要孵化48～120h，喉气管炎病毒、马立克氏病毒要孵化48～96h，痘病毒要孵化4～5ｄ，脑脊髓炎病毒要孵化至小鸡出壳。7.收毒接种鸡胚孵化到规定时间后，应从孵化器中取出放4℃环境冷冻36h左右，或在-10℃以下速冻4h左右，但不得使鸡胚冻结，否则易发生溶血。冷冻完毕按下列步骤收毒：（1）鸡胚放于蛋盘或蛋架上，气室向上，用碘酊、酒精消毒后，以无菌镊子敲开气室蛋壳或去掉人工卵窗的透明胶纸，暴露卵膜。注意不要让卵壳碎屑掉入鸡胚内。（2）根据接种部位，病毒种类或需要，收获相应的鸡胚材料如尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜、胎儿、卵黄囊等，有时需要收获全胚（除去卵黄和蛋白），如新城疫病毒、马脑炎病毒等。尿囊液：气室打开后，用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳膜，然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用巴氏吸管刺破绒毛尿膜直接吸取尿囊液。为防止羊膜堵住吸管口，可用镊子轻轻压下羊膜及胎儿，然后再吸。每个鸡胚一般可收8mL左右尿囊液。羊水：吸完尿囊液后，可用镊子夹住羊膜，将巴氏吸管直接插入羊膜腔吸取羊水，然后再用镊子提起羊膜或压住胎儿，直至羊水收获干净。相当一部分病毒其羊水和尿囊液可以混合，如新城疫，支气管炎、法氏囊病毒等。有些不能混合，则应将两者单收、单放。绒毛尿囊膜：如要收获整个尿囊膜，则在消毒、打开蛋壳、撕去壳膜后，将整个卵内容物倒出，这时绒毛尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即可。胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿放灭菌容器内即可。8.鸡胚接种注意事项（1）接种材料一般都应按每毫升1000ＩＵ或μg加入青、链霉素。（2）接种位点应避开鸡胚、血管和胚头，以免针头刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。（3）接种点最好选在胚头左侧，因一般人均右手持注射器，注射时易往左侧倾斜，这样不易刺伤鸡胚。（4）接种后注射口和气室孔均应用石蜡切实密封，防止细菌污染造成死亡。死亡鸡胚应随时取出，以免时间过长细菌繁殖并对周围鸡胚造成污染。（5）鸡胚取出冷冻时应保持气室向上，否则收获尿囊液时很困难。