第34章 DNA的复制和修复(2013-2-28)

第34章DNA的复制和修复DNAReplicationandRepairDNAReplicationDNA复制DNA修复合成反转录DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。DNA生物合成第一节DNA的生物合成DNA生物合成的方式：一、DNA复制的起点和复制方式复制子:基因组中可以独立进行复制的单位，它包括DNA每条链的一个复制起点序列和一些终止序列。1、原核生物为单复制子，真核生物为多复制子2、复制往往具有一定的起点酵母：ARS（起点识别复合物ORC识别)originofChromosomalreplication大肠杆菌：OriC（由DnaA蛋白识别）•ThreetypesofDNAsequencesinoriCarefunctionallysignificant–AT-richregion–DnaAboxes–GATCmethylationsites(autonomouslyreplicatingsequences)（originrecognitioncomplex）大肠杆菌的复制起点：OriC研究大肠杆菌DNA复制时发现，DNA复制的发动与DNA甲基化和细菌质膜有关。大肠杆菌复制起点叫oriC，由245bp构成，在oriC中有11个含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使该序列中的腺嘌呤第6位N甲基化。DNA的复制调控发生在起始阶段DNA的复制调控发生在起始阶段oriC的11个回文序列半甲基化DNA不启动复制，oriC与膜结合DNA全部复制完并延迟一定时间后，子链DNA被甲基化新一轮复制DNA复制起点的特点（1）复制起点较保守富含AT，含一些反向重复序列（2）两条链复制起点可以在不同的点上（如：D-环复制）（3）复制起点的检测方法：分子杂交（4）DNA复制的控制在起点控制，复制的速度决定于起始频率（延伸的速度比较恒定，不决定于培养基状况）DNA链的呼吸作用：DNA（复制原点处）氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。定位复制起点的方法首先将E.coli染色体，切成1%染色体长度的片段，分别进行（分子杂交），后放射自显影大肠杆菌OriC在liv位点P409思考题从大肠杆菌中分离到一个质粒，如何确定该质粒复制起点找一个已知的质粒，用酶切将这个质粒的质粒复制起点切掉，回收其它部分。将要检测的质粒使用相应的方法，如PCR、酶切等，将这个质粒分解成小片段，与无复制起点的质粒进行连接转化，有克隆产生的大肠杆菌，这个质粒里就克隆有你要的质粒复制起点。判断题1.通常DNA复制终止时并不需要特定的信号。(×)中山大学2002年生物化学试题2.真核生物DNA复制起点的序列专一性要低于细菌和病毒（×）.思考题1.一条染色体上具有多个复制子。2.同一染色体上，各复制子长度不同。3.不同生长期，复制子数目不同。如果蝇，生长旺盛期，细胞快速分裂，复制子数目可扩增十倍。4.每个复制起点在每个复制周期中只启动一次。5.相邻复制子的终点是随机碰撞会合的。真核生物复制子特点南京农业大学3.复制的类型和方式复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。（1）、直线双向复制单点，T7多点，真核染色体DNA（2）、θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E.coli.）（3）、滚环复制（单向复制）：环状单链DNA，Φx174（4）、D环复制：线粒体、叶绿体DNA（不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制，（单向复制，全连续复制，没有冈崎片段）复制的类型和方式复制的方向判断先低放射性再高放射性复制的类型和方式—D环复制•D-环扩充越过被取代链的复制起点；•被取代链启动复制，方向与第一条链相反；•两条链的合成没有冈崎片断单向复制，全连续复制复制的类型和方式—滚环复制•主要发生在病毒中,细菌F因子(Ffactor)；如φX174噬菌体•在正链DNA上打开一个切口；•以切口的3’-端为引物开始合成环链DNA的互补链，取代开环的链；3’-OH复制的类型和方式—滚环复制NOTE:cangetsingleunitgenomesormultimericcopies单向复制？复制的类型和方式—滚环复制E.coliphage(噬菌体）:ΦX174•“Template“rolls”,extrudesleadingstrand•Okazakifragsmadeonleadingstrandasitemerges.复制的类型和方式—多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2X106/（50KbX2）=42]。富营养时，可采取多复制叉复制方式，结果20min可以复制一代。真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。1.已知大肠杆菌在37摄氏度时双向复制一次约需40分钟，但在这些培养基内，细菌分裂可达20分钟一次，为什么？中山大学2000年生物化学试题思考题二、DNA复制的两个特点（一）.DNA半保留复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。1、半保留复制(semiconservativereplication)：定义：DNA复制的一种方式，每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。意义：按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。是物种稳定的分子基础，但是相对的。弥散式possiblecopyingmechanismOFDNADNA复制方式有三种可能性，即全保留、半保留和分散式。2.DNA半保留复制的证明(两个)(1)密度梯度离心(重同位素标记）1958年Meselson和Stahl采用重同位素15N作DNA标记，同时可以否定另外两种复制方式密度梯度离心(2)放射性同位素自显影•1963年，Cairns设计了一个更为严谨的实验—放射自显影的方法，进一步证实了DNA的半保留复制；•1957年，Taylor的实验证明，在真核生物中，DNA的复制也是半保留的B:（双链标记）A和C:（单链标记）H3-标记的脱氧胸苷•单链DNA首先复制合成双链的复制型（单链DNA复制时，通常先宣传双链复制型，再进行半保留复制）半保留复制非常普遍1.设计实验证明DNA是半保留复制-2012大连理工大学生物化学2.猪流感病毒HRN1是反转录病毒，试想出实验方案以阻止病毒在细胞内复制而不影响细胞内DNA正常复制。一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是第三位的磷，问是否能够达到目的？-2012山东大学生物化学3.简述MettewMeselson和FranklinStahl设计了一个什么样的实验,证实DNA的复制是半保留复制思考题华东师范大学2007年生物化学（二）、半不连续复制（P418）定义：DNA聚合酶只能按5‘—3’方向催化合成DNA不能催化3‘—5’方向合成,这样一条链连续合成和另一条链不连续合成的复制方式,称为DNA的半不连续复制.领头链随从链冈崎片段:引物半不连续复制(续1)领头链:对应3’—5‘的模板链，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。随从链:对应5‘—3’的模板链，复制的方向与解链方向相反，复制不是连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。冈崎片段:随从链中不连续的DNA片段称为冈崎片段。原核生物:1000~2000个核苷酸真核生物:100~200个核苷酸（相当一个核小体）前导链和滞后链的相对性冈崎片段不是一个复制子，其起点也非复制起点前导链和滞后链是针对某个复制叉而言的5`-5`-3`-3`-5`-3`-5`-3`-思考题1.是非判断题DNA分子是由两条链组成，其中一条链作为前导链的模板，另一条链作为后随链的模板。厦门大学2005年生物化学思考题（1）如何证明冈崎片断的存在？（2）最初对冈崎片断测定的实验表明，其数量远超过新合成DNA的一半，好象两条脸都是不连续的，试分析原因？提示：（1）同位素标记dNTP，经过一段时间后终止合成，检查发现标记出现在小片段DNA上，且小片段DNA分子量相同，数量较多。（2）前导链会少量的UMP掺入，后尿嘧啶碱基被切除形成AP位点，后该处磷酸二酯键打断，部分核苷酸，水解，造成一个缺口，后被修复，该过程会产生一些类似冈崎片断的DNA片段。脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dUTP一旦形成就被转化成dUMP?碱基切除修复N-糖苷酶核酸内切酶DNA聚合酶1N-糖苷酶又称为DNA糖基化酶解释解释UUdenature糖苷酶-ung–dump片段越长,大约有一半的新生DNA为被脉冲标记的冈奇片段dut–dump片段越短AAdUTPaseDNA没有U！解释•E.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。•尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。解释•(1)在dut-突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut+中为短。这是因为U掺入机会增加；•(2)在ung-（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。•(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。•在dut-,ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。思考题1.细胞DNA复制是半不连续的，这是因为：A.DNA聚合酶只能从3→5合成DNA链B.模板双链是反平行的C.DNA聚合酶只能一个一个地加接核苷酸残基D.DNA酶法合成是个自发过程南开大学2006年生物化学2.论述半保留复制和半不连续复制的过程2011年天津大学生物化学思考题3.DNA是以半保留方式进行复制的，如果放射性全标记的双链DNA分子在无放射性标记的溶液中经两次复制，那么所产生的4个DNA分子其放射性状况如何？A、两个分子含有放射性；B、全部含有放射性；C、双链中各有一半含有放射性；D、所有分子的两条链都没有放射性。华南理工大学2006年生物化学三、DNA复制有关的酶及蛋白质因子•底物：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP）•模板（template）：解开成单链的DNA母链•引物（primer）：提供3`-OH末端(体内为RNA,体外为DNA,如PCR反应)•酶及蛋白质因子–DNA聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶–解链（解旋酶）类，单链结合蛋白–引物酶与dnaB蛋白，拓扑异构酶–DNA连接酶（P410）ā1、DNA聚合酶反应的特点需DNA模板需引物(DNA、RNA)需4种dNTP5`→3`方向越长（化学合成方向相反）（一）DNA的聚合反应和DNA聚合酶αDNA+dNTP=DNA(n+1)+PPi思考题1.一个同学想研究DNA复制过程用放射性磷来标记底物，他标记的磷是第3位的磷，问是否能够达到目的。2012年山东大学生物化学53复制方向的证明3`→5`复制：形成5`→3`磷酸二酯键5`→3`复制：形成3`→5`磷酸二酯键链终止法测序？53复制方向的证明3`3’→5‘磷酸二酯键5‘→3’磷酸二酯键3`53复制方向的证明3`→5`复制：形成5`→3`磷酸二酯键5`→3`复制：形成3`→5`磷酸二酯键ddNTP可以掺入合成的链，造成链的终止ddNTP不能够掺入合成的链，不造成链的终止复制的方向新合成的DNA链延