第五章 酶和维生素

第四章酶主要内容：介绍酶的概念、作用特点和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶的作用机理，进而讨论影响酶作用的主要因素。第一节酶的一般性质一、酶及生物催化剂概念的发展二、酶作用的特点极高的催化效率高度的专一性易失活活性可调控有的酶需辅助因子三、酶专一性类型四、酶的化学本质酶及生物催化剂概念的发展……克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：Enzyme(天然酶、生物工程酶)核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂酶专一性类型1结构专一性概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择类别：绝对专一性和相对专一性2立体异构专一性概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求类别：旋光异构专一性和几何异构专一性绝对专一性和相对专一性绝对专一性有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。1）键专一性有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。2）基团专一性另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。消化道内几种蛋白酶的专一性（芳香）（硷性）（丙）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶消化道蛋白酶作用的专一性据酶分子组成分类单纯蛋白质酶类结合蛋白质酶类酶蛋白质辅助因子金属离子金属有机物小分子有机物据酶蛋白特征分类单体酶寡聚酶多酶复合体酶的化学本质及类别单纯酶结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子辅因子：辅酶和辅基单体酶寡聚酶多酶复合体第二节酶的组成和结构特点第三节酶的分类和命名一、命名：习惯命名；系统命名二、国际系统分类法及编号*国际生物化学会酶学委员会（EnzymeCommsion）将酶分成六大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类，5.异构酶类，6.合成酶类*每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶EC1.1.1.27大类亚类亚亚类序号酶的活性中心和必需基团酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。实例；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）羧肽酶（ribonuclease）第四节酶的活性中心和专一性AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195为Tyr248为Arg145为Glu270为底物ZnZn羧肽酶活性中心示意图酶作用专一性机理锁钥学说：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。酶专一性的“锁钥学说”酶专一性的“诱导契合学说”第五节酶的作用机理一、酶催化的中间产物理论二、酶作用专一性机理三、与酶的高效率有关的主要因素四、胰凝乳蛋白酶反应的详细机制酶催化的中间产物理论1kSE1kES2kEPE+SP+EES能量水平反应过程GE1E2酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。酶的高效率有关的主要因素1、邻近与定向效应2、诱导契合与底物扭曲变形3、共价催化4、酸硷催化5、微环境影响实例:胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从Ser转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物His57质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）羰基产物释放四面体中间物的瓦解水亲核攻击羧基产物释放第六节酶促反应动力学----影响酶促反应速度的因素一、酶促反应速度的测定与酶的活力单位二、影响酶反应速度的因素酶促反应速度的测定与酶的活力单位1、酶促反应速度的测定初速度的概念2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力测定方法：终点法动力学法检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。酶活力测定方法终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶活力的表示方法活力单位（activeunit）习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/分钟Katal（Kat）：1moL变化量/秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat）底物（μmoL）/秒·每个酶分子量度酶纯度比活力（specificactivity）量度转换效率影响对酶反应速度的因素2、底物浓度3、pH（最适pH的概念）4、温度（最适温度的概念）5、激活剂6、抑制剂1、酶浓度当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E]底物浓度对酶反应速度的影响1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线（Michaelis—Menten曲线）2、米氏方程的提出及推导3、米氏常数的意义4、米氏常数的测定单分子酶促反应的米氏方程及Km推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。1kSE1kES2kEPSKSVvmmax121kkkKm米氏方程:米氏常数:酶反应速度与底物浓度的关系曲线米氏方程的推导121kkkESSESSEt令：Kmkkk121将（4）代入（3），则：SKSVvmmax1kES1kES2kEPESEtSES[ES]生成速度：SESEkvt11，[ES]分解速度：ESkESkv212即：ESkESkSESEkt211则：SSESESKmtE(1)经整理得：SKSEmtES由于酶促反应速度由[ES]决定，即ESkv22kvES，所以(2)将（2）代入（1）得：SKSEkvmt2SKSEkmt2v(3)当酶反应体系处于恒态时：21vv当[Et]=[ES]时，mVvtmEkV2(4)所以米氏常数的意义*当v=Vmax/2时，Km=[S]（Km的单位为浓度单位）*是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。*可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。*在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[s]时的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍数表示）练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？米氏常数的测定基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的双倒数形式：1Km11—=——.—+——vVmax[S]Vmax酶动力学的双倒数图线酶促反应初速度的概念斜率=[P]/t=V（初速度）[P]tpH对酶反应速度的影响过酸过硷导致酶蛋白变性影响底物分子解离状态影响酶分子解离状态影响酶的活性中心构象pH最适pHv温度与酶反应速度的关系在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快酶的最适温度不是一个固定不变的常数v温度激活剂对酶作用的影响类别金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：Cl-、Br-有机分子还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）抑制剂对酶作用的影响凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor）。类型：不可逆抑制剂可逆抑制剂应用：研制杀虫剂、药物研究酶的作用机理，确定代谢途径抑制剂类型和特点竞争性抑制剂可逆抑制剂非竞争性抑制剂非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂+IEIESP+EE+S竞争性抑制作用实例：磺胺药物的药用机理H2N--SO2NH2对氨基苯磺酰胺H2N--COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤叶酸非竞争性抑制作用+IEI+SESIESP+EE+S+I实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）反竞争性抑制作用ESIESP+EE+S+I竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞争性非竞争性抑制作用机理示意图底物与酶专一性结合竞争性抑制曲线非竞争性抑制曲线反竞争性抑制曲线非专一性不可逆抑制剂抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型：专一性不可逆抑制剂这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。实例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第七节酶的活力测定和分离纯化第八节几种重要的酶一、别构酶及酶的别构（变构）效应二、酶的多种分子形式同工酶（isoenzyme）三、酶原的激活酶的别构（变构）效应•概念：有些酶分子表面除了具有活性中心外，还存在被称为调节位点（或变构位点）的调节物特异结合位点，调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化，导致酶的活性提高或下降，这种现象称为别构效应（allostericeffect）,具有上述特点的酶称别构酶（allostericenzyme）。•实例：天冬氨酸转氨甲酰酶（anspartatetranscarbamoylase，ATCase）•别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型酶的别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心a--非调节酶b--正协同别构酶的S形曲线别构酶的动力学曲线血红蛋白的变构效应和输氧功能正协同效应S型曲线ATCase的结构及其催化链的别构过度作用无催化活性构象(T-型)CCCCCCRRRRRR有催化活性构象(R-型)CCCCCCRRRRRRATP（正效应剂）CTP（负效应剂）别构酶的序变模型SSSSSSSSSSSSSS亚基全部处于R型亚基全部处于T型依次序变化别构酶的齐变模型SSSSSSSSSST状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基齐步变化酶的多种分子形式——同工酶概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）类别：原级同工酶；次级同工酶实例：乳酸脱氢酶研究意义：作为遗传的标志；作为临床诊断指标；研究某些代谢调节机制乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽亚基mRNA四聚体结构基因ab乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线不同组织中LDH同工酶的电泳图谱LDH1(H4)LDH