常用实验基本技术细胞培养

常用实验基本技术（续）山东大学医学院组胚教研室史玮四大常用基本技术•逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）•免疫组织化学技术（免疫组化）•免疫印迹技术（Westernblot）•细胞培养技术局限性联合应用细胞培养技术•细胞培养（Cellculture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。•细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。培养细胞的生存条件•无菌环境（器皿、超净台）•超纯水•温度（37℃左右）•气体（5%CO2/空气）•PH值（7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱）•营养条件（基础培养基+10%FBS）•渗透压、培养基质等细胞培养用液•平衡盐溶液：洗涤组织、细胞D-Hanks液、PBS液等。•消化液：分散细胞0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用•培养液：细胞生存、生长和繁殖基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化10%左右的胎牛血清（FBS）培养细胞的来源•直接取材：实验动物、胚胎、临床标本等•细胞系：各实验室保存细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、中国医科院细胞中心培养方式•原代培养：直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。只能原代培养：神经元、心肌细胞等。•传代培养：当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制，需要分散稀释后重新培养。常见：肿瘤细胞系培养细胞的处理•改变细胞外部因素•改变细胞内部因素外部因素•药物•高温•低氧•射线•…内部因素改变细胞内基因表达水平：上调：基因转染下调：RNAi细胞转染•转染（transfection）是指将外源性DNA或RNA导入细胞的过程。•上调目的基因表达：质粒载体病毒载体•下调目的基因表达：化学合成siRNA质粒载体病毒载体转染方法•电转法•脂质体介导的转染法•病毒载体介导的转染法•…转染试剂•脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。•常用：Invitrogen公司Lipofectamine2000可用来转染质粒和siRNA.•其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAXTransfectionReagent专门用来转染siRNA.瞬时转染与稳定转染•瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。•稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。真核筛选标记设立对照组•空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。•ScrambledsiRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambledsiRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的mRNA没有明显的同源性。细胞特性检测•活力：MTT实验•凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等•增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验•分化：形态学观察、分化标志物检测•致瘤性：体内成瘤实验•…靶基因表达水平检测•RT-PCR•Westernblot•免疫组化•其他：基因芯片、流式细胞术等细胞培养的应用•用途：1.验证体内实验结果2.进行深入机制研究•优点：可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象，便于施加各种干预因素，方便观察与检测。•局限性：不能准确反应体内的真实状况，需与体内实验相互验证。神经干细胞分离培养取E12.5d小鼠胚胎端脑，制成单细胞悬液，接种于神经干细胞培养基，体外培养2天，可见神经球形成。NSC鉴定体外培养神经干细胞BrdU(+)，Nestin(+)，并能分化为MAP2(+)神经元和GFAP(+)星形胶质细胞。出生后7天小鼠脑切片，可见G-CSFR与Nestin共表达。SVZ：室管膜下区；LV：侧脑室体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：Nestin（神经干细胞marker）与G-CSFR共表达于神经干细胞。RT-PCR结果也显示神经干细胞表达G-CSFR。•体外培养神经干细胞，免疫染色结果显示：与对照组相比，G-CSF作用组BrdU阳性细胞比例明显增高。•小鼠脑切片，免疫染色结果显示，与对照组（CT）及缺血缺氧性模型组（HI）相比，G-CSF处理组（HI+G-CSF）室管膜下区（SVZ）BrdU阳性细胞数明显增加。谢谢！