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第二章功能标记开发与定位第一节功能标记的概念与种类第二节功能标记开发第三节功能标记定位第一节功能标记的概念与种类•DNA标记多态性分子基础示意图分子标记在染色体上的分布5’UTR3’UTR重复区域内含子外显子基因代表标记1.1功能标记的概念•又称诊断标记,是基于生物功能已知的引起表型变异的基因内部序列多态性位点开发的分子标记。前提是目标基因的生物学功能已经明确。分子标记性状基因重复序列同源基因功能已知功能未知连锁标记功能标记基因标记1.2功能标记的种类•1.2.1SRAP标记•Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism,相关序列扩增多态性。•原理:利用独特的引物设计对ORFs进行扩增,上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增;下游引物长18bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。内含子外显子外显子内含子正向引物反向引物1.2.2SRAP标记程序•1引物设计•上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增;下游引物长18bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。上游引物下游引物5’TGAGTCCAAACCGGATA3’5’GACTGCGTACGAATTAAT3’5’TGAGTCCAAACCGGAGC3’5’GACTGCGTACGAATTTGC3’5’TGAGTCCAAACCGGAAT3’5’GACTGCGTACGAATTGAC3’5’TGAGTCCAAACCGGACC3’5’GACTGCGTACGAATTTGA3’5’TGAGTCCAAACCGGTAA3’5’GACTGCGTACGAATTAAC3’2反应体系及条件•反应体系:20L•30ngDNA模板,引物各0.3mol/L,dNTPs200mol/L,1×PCRbuffer,1.5mmol/LMgCl2,1U的Taq酶,不足部分由ddH2O补足。•反应条件:•94℃变性5min,1个循环;94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min.,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃延伸5min3产物检测及图谱分析•4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳4特点•共显性标记系统•多态性强•DNA需要量少•简单且花费少•标记分布均匀•缺点:若未利用扩增区域序列的任何信息,则产生的标记是随机分布的,严格地说,不是功能标记。若针对某一特定基因设计SRAP引物,则标记为功能标记。1.2.3TRAP标记•TargetRegionAmplifiedPolymorphism,目标区域扩增多态性,或靶位区域扩增多态性。•原理:是利用生物信息工具和EST数据库信息,产生目标候选基因区多态性标记。TRAP技术采用两个18核甘酸引物产生标记,一个为固定引物,依据EST序列设计;另一个为随机引物,针对外显子和内含子的特点,设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。1引物设计•TRAP技术采用两个18核甘酸引物产生标记,一个为固定引物,依据EST序列设计;另一个为随机引物,针对外显子和内含子的特点,设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。内含子外显子外显子内含子反向引物正向引物2反应体系及条件•反应体系:20L•40ngDNA模板,引物各0.25mol/L,dNTPs200mol/L,1×PCRbuffer,15mmol/LMgCl2,1U的Taq酶,不足部分由ddH2O补足。•反应条件:•94℃变性5min,1个循环;94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min.,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃延伸5min3产物检测及图谱分析•6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.2.4PCR-DGGE标记•基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳标记。•原理:根据功能基因结构域基序单核苷酸多态性设计引物进行特异扩增,然后将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。PCR程序•巢式或半巢式PCR:touchdowd•94℃变性4min;•退火20个循环(94℃1min,65~56℃1min,72℃1min,2个循环降1℃);•延伸10个循环(94℃1min,55℃1min,72℃1min);•续延伸,72℃6min.图谱分析•针对16srDNA结果葡萄糖262磷酸脱氢酶(G6PD)急性白血病胸苷酸合成酶(TS)1.2.5其它功能标记•针对内含子扩增的:•IFLP:内含子片段长度多态性•ISAP:内含子序列扩增多态性•SSCP-SNP:基于SNP的单链核苷酸构象多态性•针对启动子扩增的:•PRAP:启动子区域扩增多态性•针对外显子扩增的:•STS:序列标签位点•RGA:抗病基因类似序列SSCP-SNPSSCP-SNP插入缺失区检测微卫星区检测simplesequencerepeat–functionaldomainmarker(SSR-FDM)与水稻籽粒长度高度相关的GS3基因第二外显子单个SNP(C–A)功能标记•水稻GS3基因第二exon单个核苷酸由C突变成A导致籽粒增长。第二节功能标记开发•原理:基于已知功能基因序列变异区设计引物进行特异扩增,扩增产物唯一或者能容易与其他基因区分。•一个基因结构中,变异较大的是内含子区,5’UTR,3’UTR,外显子比较保守。EXONINTRONCDS(codingsequence)ORF(openreadingframe)STS功能标记开发•1获得某一已知功能的基因序列•2同源序列或等位基因比较获得变异区序列•3针对变异区设计引物•4特异扩增•5图谱分析,差异条带寻找•UniGene数据库()建立特定染色体的基因组文库随机选择克隆进行短片段单次测序比对确认不含重复序列在序列上寻找引物合成引物对基因组DNA进行PCR产物为单一片段即是STS标记,确认其在染色体上的位置如何找到一个STS举例:PPO基因STS功能标记开发2A染色体上PPO基因STS标记的分子基础2A染色体上PPO基因STS功能标记2D染色体上PPO基因STS标记的分子基础2D染色体上PPO基因STS功能标记713bp490bpPPO29与PPO16是一对互补标记,即,用PPO29扩增,高活性品种均能扩出490bp条带,低活性品种扩不出条带;用PPO16扩增,低活性品种均能扩出713bp条带,高活性品种扩不出条带。第三节功能标记定位3.1非整倍体定位技术•即用功能标记的特异引物对相应非整倍体物种基因组进行扩增分析,若哪一条染色体或染色体臂未被扩增出目标条带,则标记被定位在该染色体或染色体臂上。3.2连锁标记技术•即,寻找与功能标记紧密连锁的分子标记,计算重组率,将功能标记定位在连锁图谱上。一般所用分子标记是SSR标记。3.3FISH技术•即,用功能标记扩增得到的序列作探针,与基因组染色体进行荧光原位杂交,有杂交信号的染色体即是定位到的染色体。3.4电子定位技术•利用生物信息学和公用生物数据库工具进行查询、分析功能标记的染色体图谱位置。•习题•1什么是功能标记?•2功能标记有什么特点,分为哪些类别?•3如何开发一个功能标记?•4如何将功能标记定位到染色体上?
本文标题:第二章 功能标记开发与定位
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