第二章 动物细胞大规模培养和专用

第二章动物细胞大规模培养和专用生物反应器广州大学生命科学学院柯德森为什么?动物细胞培养对生产生物工程产品,特别是功能蛋白质方面的优势:1)同源性,直接进行翻译后加工,蛋白质可直接折叠成正确的构象2)有利于产品的分离纯化市场需求:目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。生产产品:动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战，是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污染，更为精确有效的工艺控制手段，规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。一个特殊而前景无量的生物反应器:动物乳泉生物反应器第一节常用的培养方法动物细胞有两种类型:1）非贴壁依赖性细胞(血液、淋巴组织、肿瘤组织）2）贴壁依赖性细胞（大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体细胞）培养方法1、贴壁培养2、悬浮培养3、固定化培养一.贴壁培养概念:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.一.贴壁培养微载体培养的优点:①表面积/体积比大;②微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;③培养基利用率高;④采样重演性好;⑤收获过程不复杂;⑥放大较容易;⑦劳动强度小,占用空间小.二.悬浮培养概念:是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等.是在微生物发酵的基础上发展起来的;可以借鉴微生物发酵的经验;由于动物细胞比较脆弱,所以在搅拌通气等方式上必须比微生物培养更加温和.三.固定化培养概念:利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞限制在一定的空间内,然后以固定化的颗粒进行悬浮培养.该方法对贴壁性和非贴壁依赖性细胞都是适合的.常用的包埋培养方法:对非贴壁依赖性细胞常用海藻酸钙包埋;对贴壁依赖性细胞常用胶原包埋.第二节动物细胞培养的操作方式分为5种:分批式、流加式、半连续式、连续式、灌注式一、分批式操作：概念：是将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间后，将整个反应系取出。培养过程：滞后期、对数生长期、减速期、稳定期、衰退期优点：操作简便，容易掌握，是最常用的方式；缺点：不能使细胞自始至终处于最优条件下。二、流加式操作：概念：先将一定量的培养液装入反应器，，在培养过程中随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步代谢，到反应终止时取出整个反应系。特点：1）能够调节培养环境中的营养物质浓度；2）整个过程中反应体积是变化的。存在二种流加方式：①无反馈控制流加：②反馈控制流加：最常见的流加物质：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源三、半连续式操作（反复分批式、换液培养）：概念：在分批培养操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作方式进行培养，反应器内培养液的总体积保持不变。优点：可反复收获培养液，对培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒培养过程比较实用。四、连续操作：概念：在培养过程中一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。优点：维持细胞一直处于优化状态下，促进细胞生长和产物的形成；对细胞生理和代谢规律的研究是一种重要的手段。五、灌注式操作培养：概念：细胞培养过程中一方面不断加入新鲜培养基，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。优点：可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平下的状态。第三节细胞培养过程的放大从实验室到大规模培养的5个阶段：1.筛选和开发能表达所需产物的细胞系；2.在方瓶或转瓶中确定该细胞系对营养物质和环境的要求；3.细胞培养转入生物反应器中进行，采用由生产规模缩小的实验室台式反应器，确定最佳操作方式和培养条件；4.中试规模：进一步确定过程控制方案并寻求过程的优化；5.扩大到生产规模：与中试过程密切结合，并解决在实际大规模生产中可能出现的问题。六大限制细胞生长的：1、培养基组成：血清是目前细胞培养基中不可缺少的成分，向细胞提供生长所需要的激素、转移蛋白和其他营养成分，已成为细胞培养达到最优化和降低成本的主要障碍。降低血清用量和采用无血清细胞培养基是目前研究的热点。血清培养基的主要缺点及其原因：①血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；②血清的存在是产物纯化的主要障碍；③血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险；④血清同时也有生长抑制的作用；⑤血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。2、培养条件优化和控制的困难：动物细胞培养系统能达到的细胞密度较低的主要原因是培养条件和最优化控制的困难，包括：①细胞代谢产物的毒害：乳酸、氨等；②营养物的耗竭③接种的细胞最小密度；解决问题的方法是通过过程调控来实现：灌注系统、换液、流加等，其中灌注是最好的方法。同时采用合理的培养系统以增加表面积并提供最佳的物理化学环境。3、污染的控制：污染来源包括细胞种子、血清、试剂、实验环境和操作人员。污染控制起始于细胞种子及其保存；除菌方法的改进是关键---血清？可高温灭菌的培养基的研究；设备的合理设计及操作人员的培训必不可少。4、产物表达的控制问题：问题：细胞生长的最优化条件并不一定是表达的产物的最优化条件？问题的解决在于上游分子生物学的研究5、硬件和过程设计中的问题：①细胞培养条件的控制（温度、溶解氧、二氧化碳、pH、渗透压），其中充分的氧传递是所有生物反应器中的共同问题；而其他条件对动物细胞来说可以接受的范围都比较窄。②污染的排除；③遏制潜在生物毒害物的扩散；④足够表面积的提供；⑤培养过程中剪切力的控制（搅拌、通气、收获）6、产物收获目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因在于：①血清蛋白质的污染；②细胞表达产物浓度低；③产物在培养条件下不稳定；解决方法：①使用无血清培养基；②开发在无血清培养基中稳定蛋白质产物的方法；③开发筛选技术以得到产量高的细胞克隆；④开发产物分离技术：亲和柱、中空纤维、微囊等第四节动物细胞培养生物反应器生物反应器设计必须满足的条件：①生物因素；②化学因素；③传质因素；④传热因素；⑤安全因素；⑥操作因素；反应器类型；操作方式；控制方式；搅拌方式归结到一、生物反应器的种类：悬浮培养用反应器空气提升式；搅拌槽；中空纤维管；陶质矩形通道蜂窝状生物反应器贴壁培养用搅拌槽（微载体系统）中空纤维管陶质矩形通道蜂窝状生物反应器包埋培养用流化床固定床气升式细胞培养生物反应器：优点：产物的湍流温和而均匀，剪切力相当小，对细胞损伤小，氧传递速率高；液体循环量大，细胞和营养分布均匀。一般产生泡沫不多。中空纤维管生物反应器：特点：纤维一般是横放的；优点：用途广，可用于悬浮培养和贴壁依赖性细胞培养，细胞密度高，培养基和细胞分布均匀，能长期运转通气搅拌生物反应器无泡搅拌反应器动物细胞反应器的控制溶氧控制：针对动物培养的合适搅拌，加入少量溶氧量大的不相溶溶济，改变通入气体的氮氧比；pH控制：采用通入CO2/NaOH缓冲液系统来控制，可避免局部的极端pH出现；温度和搅拌转速的控制比较简单复习试述动物细胞培养的重要性.试述动物细胞的特点及培养的对策.试述动物细胞培养的常用方法动物细胞培养的主要操作方式动物细胞大规模培养的主要障碍是什么?悬浮培养不适合动物细胞培养?动物细胞生物反应器调控pH值采用CO2/NaOH系统?血清培养是动物细胞大规模培养的主要障碍,也是污染的主要来源,并且是蛋白纯化的主要障碍?