2.2.1动物细胞培养和核移植技术(最新修改版)

2.2动物细胞工程•生产单克隆抗体等动物细胞工程常用的技术•动物细胞培养•动物细胞核移植•动物细胞融合是其他动物细胞工程技术的基础。为什么要进行动物细胞培养?一.动物细胞培养如何进行细胞培养?2.2.1动物细胞培养和核移植技术从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。(一)概念实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等原理：细胞增殖1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？P44旁栏提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？P44寻根问底提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。(二)动物细胞培养过程•胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液10代细胞50代细胞剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖缓慢，核型可能变化动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型传代培养动物组织块细胞悬液原代培养传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎细胞贴壁接触抑制原代培养传代培养加入培养液用胰蛋白酶等处理贴壁细胞适宜条件不死性细胞动物细胞生长特点：★细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。★要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。★细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制动物细胞生长特性部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。二、动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境（无菌处理，添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、充足的营养供应（合成培养液，葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、适宜的温度和PH36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2维持培养液的pH）保证细胞顺利的生长增殖思考：动物血清的作用？主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。与植物培养基相比其特点是：（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境植物组织培养呢？无机盐、蔗糖、维生素、生长调节物质、植物激素成分比较：对比：动物细胞培养、植物组织培养..植物组织培养技术动物细胞培养技术原理培养基结果分散处理脱分化细胞全能性细胞有丝分裂固体,营养物质,激素液体,营养物质,血清等完整植株细胞群或细胞产物无有有无植物组织培养技术是植物细胞工程技术的基础。动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础。复习植物细胞工程和动物细胞工程的部分内容。•P47最上面•1、大规模的生产生物制品。•2、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。•3、检测判断物质的毒性。•4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于等，为及其他疾病提供理论依据。(四)动物细胞培养技术的应用筛选抗癌药物治疗和预防癌症1．关于动物细胞培养的有关叙述中正确的是A．细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中B．动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清C．动物细胞培养的目的只是获得大量的细胞分泌蛋白D．动物细胞培养前和培养过程中都需要用胰蛋白酶处理D相互接触接触抑制单层胰蛋白酶衰老或死亡不死性降低减少活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。中低温新陈代谢酶抗原二.动物细胞核移植技术和克隆动物将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易(一)、动物细胞核移植概念：(二)、体细胞核移植的过程：请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎卵母细胞采集、培养MⅡ期卵母细胞供体牛供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）物理方法：电脉冲等。化学方法：钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等•整个过程用了哪些技术？–细胞培养、核移植、胚胎移植•新生牛的性别、基因？–与供体相同•繁殖方式？–无性繁殖•原理？–动物细胞核的全能性母绵羊A乳腺细胞（体细胞）母绵羊B未受精的卵细胞母绵羊C“多莉”新的卵细胞发育成早期胚胎去核卵细胞提取细胞核核移植胚胎移植体细胞核移植技术克隆羊遗传物质来自：供体细胞细胞核A卵母细胞细胞质BP49讨论：1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏(P49小资料）。培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？核移植动物的核DNA来自于供体细胞，质DNA（线粒体DNA）来自于卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。(三)、体细胞核移植技术的应用前景：1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病定向诱导培养液中加入分化诱导因子：牛黄酸、丁酰环腺苷酸(四)、体细胞核移植技术存在的问题：研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。思考与探究1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。1.用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是A．都需用培养箱B．都须用液体培养基C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性C巩固练习：外界条件适宜，植物细胞不需要。动物细胞培养一般需要培养箱。2、下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是A.培养基成分不同B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株A3、动物细胞工程技术的基础是A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养D愈伤组织条件适宜可以传代培养不分化。4、细胞株的特点是A．遗传物质没有改变，可以无限传代B．遗传物质发生改变，不可无限传代C．遗传物质没有改变，不可无限传代D．遗传物质发生改变，且有癌变特点，可以无限传代5、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为:A．原代培养B．传代培养C．细胞株D．细胞系CD6、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞A.容易产生各种变异B.具有更强的全能性C.取材十分方便D.分裂增殖的能力强D7.（09江苏）下图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意图。请回答下列问题。（1）肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细胞。（2）气室中充入5％C02：气体的主要作用是。（3）培养液中添加抗生素是为了抑制细菌生长，但要注意选择抗生素的，以保证抗生素对肝脏无害。吸收氧气和营养物质、排出代谢废物维持培养液适宜的pH种类和剂量08年宁夏卷回答下列有关动物细胞培养的问题：⑴在动物细胞培养的过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是，要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。⑵随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。相互接触单层胰蛋白酶衰老甚至死亡接触抑制不死性降低减少⑷检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。⑸在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞，因为在这种条件下，细胞中的活性降低，细胞的速率降低。⑹给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作进行攻击。中冷冻酶新陈代谢抗原动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于[]A、培养基不同B、动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C、动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能D、动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株巩固练习A动物细胞工程技术的基础是[]A、动物细胞融合B、胚胎移植C、动物细胞培养D、核移植巩固练习在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是[]A、细胞系B、细胞株C、原代细胞D、传代细胞CA下列不属于克隆的是[]A、生物体通过体细胞进行的无性繁殖B、将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系C、扦插和嫁接D、将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA中巩固练习D植物体细胞杂交的结果是[]A、产生杂种植株B、产生杂交细胞C、原生质体的融合D、形成愈伤组织巩固练习A植物体细胞杂交的目的是[]A、产生杂种植株B、产生杂交