DNA提取实验方案

一、脱腐1.10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml脱腐缓冲液[100mmol/LTris-HCl,PH10.0,50mmol/LNa2EDTA,200mmol/LNaCl,100mmol/LNa4P2O7,1%(质量浓度)PVP,0.05%（质量浓度）TritonX-100]，漩涡混合3min，60℃水浴5min，3000×g离心3min。根据上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（土壤与沉积环境样品腐殖酸脱除新方略，席峰）2.10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5mlPBSbuffer(8gNaCl，0．2gKC1，1．44gNa2HPO4，0．24gKH2PO4，溶于1L水中，pH=7．4)旋涡混合3min,60℃水浴5min,3000×g离心3min。根据上清颜色再重复洗涤与离心1-2次，至上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（从颗粒污泥中提取DNA的几种不同方法比较，陈竹）二、裂解与提取1.冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS法（可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA提取方法研究，高平平）1)置0.5g沉积物（干重）于10ml的灭菌离心管中离心5min(8000×g,4℃),弃上清,沉淀(约100mg)悬浮于5ml无菌水中。向管内加入0.35g灭菌玻璃珠(直径2～3mm),将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打15min,离心8min(8000×g,4℃),弃上清,沉淀用于细胞裂解。2）向沉淀中加入0.5ml灭菌的TENP缓冲液(50mmol/LTris-base,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,0.01g/ml聚乙烯吡咯烷酮,pH10),悬浮后将菌液在液氮中冷冻3min,沸水煮2min,重复3次后进行菌体离心(10min,12000×g,4℃)。上清液快速置于冰上留用,沉淀用于进一步裂解。3）将沉淀悬浮在1.5ml的溶菌酶溶液中(0.15mol/LNaCl,0.1mol/LNa2EDTA,15mg/ml溶菌酶,pH8),其中溶菌酶配制成30mg/ml的母液,-20℃保存备用。37℃温浴1h后,向菌液中加入1.5ml10%SDS溶液(0.1mol/LNaCl,0.15mol/LTris-HCl,10%SDS,pH8),上下摇匀,待菌液变清后离心10min(12000×g,4℃),取上清置于冰上留用。4）收集两步的DNA上清液(3～3.5ml),用等体积的Tris-饱和酚抽提2次、酚+氯仿和氯仿各抽提1次。用40ul的3mol/L乙酸铵和3ml无水乙醇沉淀DNA,-20℃放置30min后离心(20min,14000×g,4℃)。用1ml的70%乙醇洗涤沉淀,离心10min(10000×g,4℃)。DNA沉淀真空干燥后,溶于50ul超纯水中,加RnaseA3ul(10mg/ml),37℃温浴15～20min消化RNA,样品在-20℃保存备用。2.CTAB+溶菌酶+SDS法1）称取0.5g干沉积物，置于灭菌的10mL离心管中2）向离心管中加入1.35mLDNA裂解液（100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，1%CTAB，pH8.0，121℃高温灭菌），充分混匀，再加入溶菌酶50uL（100mg/ml），混匀，37℃温育30min；然后加入5uL蛋白酶K（20mg/mL），混匀后37℃温育30min。3）向以上混合液中加入300uL10%SDS，混匀，与65℃温育10min。然后4000rpm，4℃离心10min。离心后移取上清液到灭菌的2ml离心管中。4）向离心后的沉淀中加入450ul裂解液，100uL10%SDS,混匀后65℃温育10min，4000rpm，4℃离心10min，取上清液到灭菌的2mL离心管中。此步骤重复两次5）将三次取得的上清液混合，分装到灭菌的2mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），反复颠倒混匀三次，12000rpm离心5min。小心移出上清（蛋白层很细小）到灭菌的2mL离心管中。6）重复上步骤，将最后所得上清液置于灭菌的1.5mL离心管中7）向上清液中加入0.6倍体积异丙醇，4℃放置至有丝状沉淀出现。12000rpm离心10min，小心弃去上清8）向沉淀中加入1mL4℃预冷70%乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心2min，小心弃去上清。9）将DNA沉淀置于无菌台中用无菌风吹干。向其中加入50uL无菌水（超纯水高温高压灭菌，以下步骤中无菌水均为灭菌超纯水），置于室温至其完全溶解。10）将DNA置于-20℃保存3.玻璃珠+CTAB+SDS法（土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取，赵勇）1）在预处理好的沉积物样品中加入0.35g灭菌玻璃珠(直径约1mm)和2mLDNAextractionbuffer(100mmol/LTris，100mmol/LEDTA，200mmol/LNaC1，2％PVPP，3％CTAB，pH9．0)，高强度旋涡振荡10min2）加入2mLSDSbuffer(100mmol/LTris，200mmo1/LNaC1，3％SDS，pH9．0)，温和旋涡振荡10min3）65℃水浴30min(水浴过程中每隔10min用手上下颠倒离心管3次)8000rpm室温离心15min4）收集中间的液相层剩余的残渣中再加1mLDNAextractionbuffer和1mLSDSbufier．65℃水浴5min5）8000rpm室温离心15min，收集中间的液相层6）合并液相层，按上述方法再把残渣抽提1次，收集的液相层与上两次的液相层合并，12000rpm室温离心5min，收集上清液7）等体积的氯仿／异戊醇(24：1)抽提1次，15000rpm室温离心20min，收集上清液8）在上清液中加入0．1倍体积的3mol/LNaAC(pH5．2)，用手颠倒混匀后，再加入0．6倍体积异丙醇室温沉淀DNA1h，15000rpm室温离心20min，弃上清液9）DNA沉淀用70％乙醇洗涤1次，冷冻干燥后将DNA沉淀溶于500mL灭菌ddH2O中三、纯化1.凝胶电泳法1）配制0.8%琼脂糖凝胶称取0.8g琼脂糖，加入到100mL1×TAEbuffer中，摇匀，使用微波炉解冻档加热至融化。将融化的琼脂糖倒入制胶模具中至完全冷却2）取5uL粗提DNA与1uL6×loadingbuffer混匀，点样3）130V恒压电泳2h4）电泳结束后，于EB染色液中染色20min，使用凝胶照相设备照相检测如果粗提DNA条带较清晰，并无明显拖尾即可进行下一步的凝胶回收纯化步骤。1）取100uL粗提DNA溶液混合10uL6×loadingbuffer点样，130V恒压电泳2h。2）将电泳后的凝胶置于EB染色液中染色20min，在紫外灯下观察条带位置，注意不要在紫外灯下照射过长时间。3）用灭菌的手术刀将基因组DNA条带切割下来，切成碎片，置于已称重的2mL灭菌离心管中。4）参照胶回收试剂盒说明书进行凝胶回收过程。（最后一步用无菌水洗脱时先将无菌水加热至60℃后使用）5）洗脱DNA时先加入无菌水洗脱一次，收集滤液，标记编号后于-20℃保存。然后再次用无菌水洗脱离心吸附柱，收集滤液，标记编号后于-20℃保存2.葡聚糖凝胶G-200离心层析纯化1）取2ml灭菌过的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭菌过的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm2）向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析住3）将注射器置于10ml离心管中，于离心机上以3000rpm离心20min4）去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液5）将离心层析住置于另一10ml的离心管中在层析柱顶部加入5ul粗提DNA，以10min为周期于3000rpm离心，分别收集层析液，层析液浓缩至5ul3.葡聚糖凝胶G-200与凝胶电泳结合法先将DNA粗提物用葡聚糖凝胶纯化，再将层析液用方法1进行纯化。四、PCR扩增1）取纯化后的基因组DNA1uL，用无菌水稀释至10-1倍后作为模板DNA使用2）PCR反应体系：贮存浓度加入体积10×PCRbuffer：2.5uLPr：50uM0.2uLPf：50uM0.2uLTaq聚合酶:1U/uL1UdNTP:2mM2.5uLH2O:10uL模板：10uL反应体系要在冰上配制先确定要配制的反应体系总量，然后向离心管中依次加入需要总量的无菌水、10×PCRbuffer、上下游引物、dNTP，最后加入Taq聚合酶。然后将上述混合物瞬时离心混匀，分装到各个PCR管中。然后将模板加入到PCR管中，瞬时离心混匀。然后将其放入到PCR仪上开始扩增反应。3）PCR反应条件（TouchdownPCR降落式PCR）94℃5min94℃1min65℃-55℃30s每两个循环降低1℃退火温度，降低到55℃后开始10个循环72℃90s72℃10min4℃10min4）PCR完成后，取5uL样品，于1%琼脂糖中，100V电泳1h检测PCR样品。