IEF使用过程中常见问题及解决方法

IEF使用过程中常见问题及解决方法以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。问题可能原因解决方法初始电流低或为零•IPG胶条与电极接触不好.•检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上.•PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全.•检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触.•IPG胶条水化不完全•确保IPG胶条完全并平均地进行水化。检查水化液体积及水化时间.在升压过程中电压不上升.•盐浓度过高•检查盐浓度并对样品进行除盐处理.电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢•Bio-Lyte浓度过高•将Bio-Lyte浓度降至0.2%(v/v).•对不同尺寸的IPG胶条和pH梯度电压设置过高.•在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦.•过多的样品在水化过程中未能进入胶条,或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨•如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条,或在聚焦前除去多余的样品液.电压及电流波动很大.(同时电阻错误信息会显示)•IPG胶条中有水化较差的区域,或IPG胶条在运行过程中已经烧干.•检查水化缓冲液体积及时间.确保在水化期间水化缓冲液平均地分配.•限流过高.•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.问题可能原因解决方法烧胶条(这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示.)•限流过高.•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.•IPG胶条已经烧干.•确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干•电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.•确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态.•水化缓冲液成份不合适,盐浓度过高.•检查水化缓冲液浓度。必要时重新配制缓冲液.双向电泳实验中常见问题一、水平条纹出现的问题:胶上出现连续性横纹。可能的原因:蛋白质没有完全和稳定溶解。推荐解决的方法:用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS,ASB-14），两性电解质和还原剂（DTTorTBP）非常重要。每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：o8–9Murea,4%(w/v)CHAPS,2mMTBPor50mMDTT,40mMTris,0.2%(w/v)Bio-Lyte3/10Ampholyteo7Murea,2Mthiourea,4%(w/v)CHAPS,2mMTBPor50mMDTT,40mMTris,0.2%(w/v)Bio-Lyte3/10Ampholyte样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（10,000rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。推荐产品:ReadyPrepproteinextractionkit(totalprotein/全蛋白)出现的问题:出现不连续的横纹。可能的原因:样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA,RNA),脂类,多糖和酚类化合物。推荐解决的方法:以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2-Dcleanupkit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。最终，样品中SDS的含量须低于0.25%(w/v)，样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：1。如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。在样品中加入0.1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0.25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴(Blombergetal.1995).注意：Mg2+离子是DNase活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。建议通过TCA/丙酮沉淀(Damervaletal.1986)；或者醋酸铵沉淀后酚抽提(HurkmanandTanaka1986)；或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。脂类：蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物(WesselandFlugge1984)。酚类化合物：植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone(PVP)orpolyvinylpolypyrrolidone(PVPP)吸附。2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。3.氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮(Damervaletal.1986).，可以抑制酚氧化。推荐产品:ReadyPrep2-DcleanupkitBio-Spin/MicroBio-Spin6columns出现的问题:出现不连续的横纹。可能的原因:样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA,RNA),脂类,多糖和酚类化合物。推荐解决的方法:以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2-Dcleanupkit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。最终，样品中SDS的含量须低于0.25%(w/v)，样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：1。如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。在样品中加入0.1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0.25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴(Blombergetal.1995).注意：Mg2+离子是DNase活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。建议通过TCA/丙酮沉淀(Damervaletal.1986)；或者醋酸铵沉淀后酚抽提(HurkmanandTanaka1986)；或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。脂类：蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物(WesselandFlugge1984)。酚类化合物：植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone(PVP)orpolyvinylpolypyrrolidone(PVPP)吸附。2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。3.氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮(Damervaletal.1986).，可以抑制酚氧化。推荐产品:ReadyPrep2-DcleanupkitBio-Spin/MicroBio-Spin6columns出现的问题:胶部分出现横纹。可能的原因:蛋白上样量过高。推荐解决的方法：a）稀释样品，降低样品浓度。在进行IEF前，须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。b）使用长IPG胶条，和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量，详细请见下表：IPGStripLength7cm11cm17cm18cm24cmRehydrationvolumeperstrip125µl185µl300µl315µl410µlProteinloadSilverstain5–20µg20–50µg50–80µg50–80µg80–150µgSYPRORuby5–20µg20–50µg50–80µg50–80µg80–150µgCoomassieBlueG-25050–100µg100–200µg200–400µg200–400µg400–800µgc）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70-90%。如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖对其他蛋白的观察。减少或除去样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹，有利于对低丰度蛋白的观察。推荐产品：a)RCDCproteinassayb)PROTEANPlus(24cm)orPROTEANII(17cm)precastgelsc)AurumserumproteinandAurumA