第十一章-基于靶点结构的药物分子设计

第十一章基于靶点结构的药物分子设计药物设计学【学习要求】1.掌握基于靶点结构的药物设计、全新药物设计、计算机虚拟筛选、基于片段药物设计的基本概念。2.熟悉蛋白质三维结构预测法、分子对接方法及分类、基于片段药物设计的基本思路、基于片段药物设计的优点；片段筛选的主要检测技术；片段优化的常用方法。3.了解全新药物设计的常用方法、磁共振检测技术的分类和原理；SAR-by-NMR的原理和应用；Tether和二次Tether技术的原理；结晶筛选的研究流程。基于靶点结构的药物设计•是指一般应用由X射线衍射、磁共振或分子模拟（同源建模法等）提供的蛋白质结构信息，来辅助设计具有生物活性的化合物的过程。基于配体结构的药物设计•是从研究一系列药物分子对同一受体的活性出发，比较它们的结构变化与生物活性之间的关系，找到对该受体能发生结合并产生活性的最普遍的结构因素，并根据此结构特征设计新的药物分子。以靶点结构为主的药物设计可分为三大类•全新药物设计：根据靶点活性位点构建配体•分子对接：以靶点结构来搜寻配体•基于片段的药物设计：根据靶点活性位置来构建配体片段基于生物大分子靶点结构的药物设计方法靶点-配体复合物晶体结构结合位点分析配体设计配体合成活性测试数据库搜索购买少量化合物全新药物设计分子对接片段设计配体设计片段药物设计第一节靶蛋白结构的预测•蛋白质结构与功能研究已成为后基因组时代最具挑战性的研究课题。•当前测定蛋白质结构的主要方法仍然是X-射线晶体学方法和多维核磁共振技术。•蛋白质结构的测定速度却远远落后于基因组测序和氨基酸序列的测定速度，无法满足蛋白组学及其相关的学科需要。（1）目标序列与模板序列的比对；（2）根据同源蛋白的多重序列比对结果，确定同源蛋白的结构保守区以及相应的框架结构；（3）目标蛋白质结构保守区的主链建模；（4）目标蛋白质结构变异区的主链建模；（5）侧链的安装和优化；（6）对模建结构进行优化和评估。同源模建的主要步骤序列比对•序列比对是同源模建的关键，大多数的序列比对方法都是以目标蛋白质和模板蛋白质序列之间的相似性为基础的，其准确性可以通过进行多序列比对得到提高。目前常用的序列比对程序有FASTA和BLAST等。许多药物设计软件公司也开发了同源模建法预测蛋白的软件模块，如Tripos公司的Composer、Accelyrs公司的Homology等。折叠识别（foldrecognition）•当目标蛋白质找不到已知结构的蛋白质作模板时，可以采用蛋白质折叠识别方法进行三维结构预测。•折叠识别法就是总结出已知的蛋白质结构模式作为目标蛋白质进行匹配的模式，然后经过现有的数据库的观察，总结出可以区分正误结构的平均势函数作为判别标准，来选择最佳的匹配方式。从头预测（denovoprediction）•蛋白质结构从头预测是一个尚未成熟的研究领域，但发展潜力十分巨大。因为该方法不需要知道任何一个目标序列的同源蛋白质，仅从蛋白质的一级结构预测其高级结构，一旦从头预测的方法获得重大突破，将有助于人们理解蛋白质折叠的过程，影响蛋白质结构稳定性的因素等基本问题。活性位点的分析方法•通过探针来探测简单的分子或碎片如何能够与生物大分子的活性位点很好地结合。用于分析的探针可以是一些简单的分子或碎片，例如水或苯环作为探针，通过分析它们与活性位点的相互作用情况，可以找到这些分子或碎片在活性部位中的可能结合位置。•活性位点分析法通常不能直接产生完整的配体分子，但它得到的有关靶点结合的信息对后面的全新药物设计和分子对接等都有很好的指导意义。•代表性的活性位点分析方法的软件有GRID、MCSS和HINT等相关程序。GRID•GRID程序由Goodford研究小组开发，其基本原理是将靶点蛋白的活性部位划分为有规则的网格，应用分子力场的方法计算探针分子（水分子或甲基等）在不同的格点上与受体活性部位的相互作用能，以此解析探针分子与靶点活性部位的相互作用情况，发现最佳作用位点。•应用GRID程序研究流感病毒的重要靶点神经氨酸酶时，以氨为探针分子搜寻神经氨酸酶结合位点时发现用胍基取代抑制剂Neu5Ac2en的4-羟基，得到的化合物扎那米韦（zanamivir）活性大为提高，现已作为抗A型感冒病毒药物上市。MCSS•MCSS是Karplus课题组发展的一种活性位点分析方法，其基本思路与GRID方法相似，但处理方式更为细致、深入。例如GRID方法中仅考虑探针和蛋白质的非键相互作用，而MCSS法进一步包括了探子分子片段的构象能；GRID计算采用系统搜索法将探针分子片段依次放在每个格点上，而MCSS法将探针分子以多拷贝形式放置在活性口袋中，利用蒙特卡罗模拟结合分子力学进行优化来寻找最佳作用位点。•Adlington等应用MCSS对前列腺特异性免疫抗原（PSA）的活性位点进行了详细分析，以此对已有的PSA抑制剂进行结构优化，从而得到了迄今为止活性最高的PSA抑制剂，其IC50为（226±10）nmol/L。HINT•HINT（hydrophobicinteraction）是Kellogg等研究的计算分子脂水分配系数及评价的程序，目前已商业化并已有SYBYL和InsightⅡ下的版本。在SYBYL最新版本中，HINT已作为一个正式模块推出，并能够进一步计算和显示疏水场及两分子间的疏水相互作用，并为CoMFA计算提供疏水场值。第二节分子对接与虚拟筛选•分子对接（moleculardocking）是通过研究小分子配体与靶点生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力，进而实现基于结构的药物设计的一种重要方法。根据配体与靶点作用的“锁钥原理”，分子对接可以有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征互补匹配的小分子化合物。一、分子对接分子对接方法的分类•根据对接过程中是否考虑研究体系的构象变化，可将分子对接方法分为以下三类：刚性对接、半柔性对接和柔性对接。①刚性对接是指研究体系的构象在对接过程中不发生变化；②半柔性对接是指在对接过程中研究体系中的配体构象允许在一定范围内变化；③柔性对接是指研究体系在对接过程中构象可以自由变化。•根据对接时配体分子的形式还可以将分子对接方法分为两种基本类型，即整体分子对接法和片段对接法。•整体分子对接法是运用特定搜索算法考察配体分子在靶点结合部位，根据评分函数找出最优结合方式。•片段对接法是将配体分子视为若干片段结构的集合，先将其中一个或几个基本片段放入结合空腔，然后在活性部位构建分子的其余部分，最终得到理论上最优的结合方式。1.DOCK（1）应用程序产生一个填充靶点分子表面的口袋或凹槽的球集,整理成假定结合位点。（2）在假定结合位点上，应用一组球集表示配体，按照匹配原则确定配体与靶点的作用位点。（3）评价打分，DOCK支持多种评分函数，可以评价靶点活性部位与配体几何形状互补性、范德华作用和静电作用等。有代表性的分子对接软件2.FlexX•第一步是选择配体的一个连接基团，称为核心基团；•第二步是将核心基团放置于活性部位，此时不考虑配体的其他部分；•最后一步称为构造，通过在已放置好的核心基团上逐步增加其他基团，构造出完整的配体分子。3.Affinity•第一步是应用蒙特卡罗或模拟退火法计算确定配体分子在靶点活性口袋的可能结合位置；•第二步是通过分子力学或分子动力学方法进行细致对接。DOCK分子对接步骤•对配体和靶点结构分别加氢原子、力场参数和电荷•计算蛋白溶剂表面•结合部位模拟•计算结合部分能量网格•打分评价•寻找最佳匹配位置分子对接应用举例•通过对HIV-1蛋白酶与天门冬氨酸蛋白酶的结构进行比较，并借助X-衍射波谱的结果，人们获得了高精确度（1.8nm）的HIV-1蛋白酶的三维结构，并建立起该酶的结构模型。随后，Desjarlais等人根据其晶体结构中的酶活性部位，利用DOCK程序将剑桥晶体数据库中的10000个分子与之进行分子对接，按照打分数值的高低排列。•然后对打分值最高的200个化合物进行严格筛选，评价这些分子能否与酶的Asp25发生相互作用。最后发现溴哌醇具有较好的结合作用，经生物学实验测试表明，其Ki值为100mol/L，且选择性很高。溴哌醇高通量筛选的缺陷•传统的高通量筛选遇到许多问题，一方面是药理测试假阳性结果，另一方面是化合物样品来源短缺。尽管已报道的化合物数量非常庞大，但实际制药公司和有关研究机构现有的样品库却数量有限，这种情况在我国表现更为突出。二、计算机虚拟筛选技术•利用现代计算机虚拟筛选技术可以有效克服上述困难，它利用计算机强大的运算能力，根据某个靶标的相关信息，利用三维药效团搜索或分子对接的方法，对商业化的化合物样品库进行虚拟筛选以寻找可能的活性化合物，发现潜在的活性分子后，可以向公司或有关机构定购，然后进行药理测试。•与传统的高通量筛选技术相比，虚拟筛选不存在样品的限制，其成本也远低于高通量筛选。小分子三维数据库•剑桥结构数据库（Cambridgestructuraldatabase，CSD）是由剑桥大学的剑桥晶体数据中心（Cambridgecrystallographicdatacentre）提供的有关有机小分子晶体结构信息的三维结构数据库系统。•在CSD中，所有这些晶体结构都是通过X-射线或中子散射实验技术获得。目前，CSD包含超过25700个有机化合物、金属有机化合物以及金属配合物的晶体结构信息，其中约有89%的分子有明确的三维结构数据。剑桥结构数据库国家癌症研究所数据库•到2000年为止，国家癌症研究所数据库（nationalcancerinstitutedatabase，NCI数据库）共收集了约500000个化合物。尽管很多学术机构、政府部门及一些非营利组织提交测试的化合物没有任何限制条件，但是企业研究所通常要求对它们提供的化合物结构和测试结果遵守保密协议。NCI数据库中近一半的保密化合物公众无法获得。•NCI数据库最大的特点是拥有与之相配套的对公众开放的实物库。一般情况下，在NCI数据库中始终有约60%的化合物实物储备。ACD-3D数据库•ACD-3D数据库是MDL数据库的一种，是用户检索化学品供应商和价格信息的一种有效途径。目前，ACD-3D包含从世界范围内的651种化学品目录中收录的将近40万个化合物的信息，其中约33万个具有三维结构，是目前世界上最大的可获取的商业化学品结构数据库。数据库每半年更新一次。数据库中的信息包含化学品的纯度、类型、等级、剂量和可比价格等。•2003年MDL公司为了迎合高通量筛选而开发了数据库availablechemicalsdirectory3D-screening（ACD-SC）。该库的数据主要来自于42个商业化学品供应商的产品目录。这一数据库提供了化学品供应商所能够提供的超过200万个化合物的三维结构及相关信息。ACD-SC可以说是ACD-3D的扩展，而且所有的化合物都可以找到相关购买信息。MDLdrugdatareport3D（MDDR-3D）•MDDR数据库是MDL数据库产品中的一种。它的数据来源包括1988年以来11个国际专利部门的资料以及1500种期刊和300种会议论文中出现的约100000种与生物研究相关的化合物及其衍生物。该数据库每月更新一次，每年化合物增长规模在10000种左右。数据库中收录信息的特点是包括生物活性和药理性质方面的数据。虚拟筛选的策略二维分子数据库蛋白质结构三维结构转化结构优化质子化/电荷归属结构优化构想产生数据归属确定结合位点分子对接打分评价并选择分子候选分子基于分子对接的虚拟筛选流程图小分子数据库准备蛋白质结构准备二维分子数据库蛋白质结构原子／键类归属三维结构转化结构优化原子化／电荷归属结构转化构象产生数据归属结合位点确定网格构造分子对接打分评价／选分子类药性判断侯选分子虚拟筛选后续分析高通量筛选和虚拟筛选方法的比较方法测试化合物数量IC50100mol/L命中数量IC5010mol/L命中数量命中率（%）高通量筛选40000008560.021基于分子对接的虚拟筛选3651272134.8•Doman等以2型糖尿病的靶点——蛋白酪氨酸