细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡的检测方法报告人：王英时间：20151127细胞凋亡的形态特征细胞核缩小，染色质边缘化，出现凋亡小体。细胞凋亡和坏死的区别---细胞凋亡是一种主动的，程序性的死亡过--不造成炎症和自体损伤--细胞坏死指细胞在各种致损伤因素作用下无序死亡的过程-形态特征为细胞胀大，胞膜破裂，胞浆内容物外泄-局部导致炎症反应综述目的过量或过少的细胞凋亡均对机体有害。人类和动物的好多疾病的发生都与细胞凋亡有密切关系，若能恰当的加速或阻断细胞凋亡，可为有效防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径。因此细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的关键步骤。近年来有不少综述著作分别介绍了植物发育过程中的细胞凋亡，环境胁迫下诱导的细胞凋亡、植物细胞凋亡的机理以及发育调控、在植物发育中的细胞凋亡作用、植物细胞凋亡与活性氧及抗氧化代谢的关系等，但对细胞凋亡的检测方法则很少报道。本文主要从以下几方面对检测细胞凋亡的技术加以阐述。细胞凋亡的体内检测尽管细胞凋亡在维持多细胞生物机体稳态、生长发育等生命活动中发挥重要作用。但是不正常的细胞凋亡会导致组织功能紊乱,包括自身免疫疾病、神经退行性疾病、肿瘤等。肿瘤的治疗方法很多，有效的肿瘤治疗包括通过化疗药物诱导体内细胞凋亡。临床上迫切需要非损伤性的方法来检测癌症病人使用药物的效果,以及对新药药效作出评价。因此,体内细胞凋亡检测试剂备受瞩目,目前只有处于临床阶段的体内细胞凋亡检测试剂,常规检测试剂尚未出现。体内检测AnnexinVSynaptotagminI-C2AApoSese体内检测-试剂盒细胞凋亡检测方法体外检测细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的DNA片段化检测(DNAladder,TUNEL检测法,ELISA检测法)细胞凋亡的线粒体膜电位的检测细胞凋亡的相关基因的检测(凋亡促进基因的表达检测,凋亡抑制基因的表达检测)细胞凋亡的流式细胞术检测细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测形态学检测原理：DNA特异性燃料（Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等）与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合，从而使细胞核着色，在紫外光激发时会出现明显的荧光。通过荧光显微镜可观察到细胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变。优点：简便易行，可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象。缺点：观察凋亡细胞的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡样本的检测。DNAladder原理：细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA被切成50-300kb大小的片段，然后进一步分解成约180bp的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带，而坏死细胞DNA则被降解成弥散的条带。TUNEL法原理：细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180bp～200bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色。缺点：但TUNEL法也有局限性。如:组织固定、处理的过程本身会改变检测结果,对细胞凋亡不是特异性的,坏死细胞也会被标记。ELISA法应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。细胞凋亡的DNA片段化检测DNAladder：优点:经典的检测细胞凋亡的指标缺点：DNA凝胶电泳特异性高但灵敏度低，不适于检测凋亡初期DNA轻微损伤的检测TUNEL法优点：敏感、快速。特异性强缺点：局限性，如：组织固定、处理的过程本身会改变实验结果。对细胞凋亡不是特异的，坏死细胞也会被标记。ELISA检测法优点：此法既可定性，又可定量。且适合检测大量样本，且灵敏度高。线粒体膜电位的检测线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度,在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。而且一旦线粒体膜电位耗散,凋亡就不可逆转。线粒体膜电位变化的检测属于电化学的方法,使用时需始终保持平衡染液pH的一致性。流式细胞术检测优点：分析精确，重复性好，费用低廉，分析速度快，检测的细胞数量大，可定量分析群体细胞的凋亡及同时进行其他相关的分析缺点：不能检测出细胞群体异质性流式细胞分析法可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选，是定量检测细胞凋亡的重要方法之一。流式细胞术主要包括多种方法，其中AnnexinV/PI法是目前较为流行的检测细胞凋亡的方法。钙离子浓度变化检测凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要信号通路：线粒体通路，内质网通路，死亡受体通路。这些信号通路大部分与钙离子有关，最终都能激活凋亡执行者Caspases3,水解各种细胞成分而使细胞凋亡。在钙离子信号与肿瘤细胞形成的三条通路中，存在相互促进，互为因果的促凋亡蛋白酶，加速了肿瘤细胞的凋亡。虽有关钙离子信号调控细胞凋亡的证据越来越多，但是钙离子如何激活这些凋亡调节因子的分子机制现在仍不清楚。一旦完全认识了Ca与细胞凋亡的关系，必将为凋亡研究带来突破性进展，为疾病特别是肿瘤细胞的治疗提供新的思路和手段。优点：由于流式细胞术不能检测出群体细胞的异质性，但钙离子浓度变化检测能对多项生化指标进测定，固该法由较高的优越性。细胞凋亡意义细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演者重要角色。其一，有利于清除有害细胞，在研究自身免疫性疾病，病毒感染和肿瘤的机制中发现自身反应性T,B淋巴细胞，某些病毒感染细胞可通过细胞凋亡方式被清除。推测机体利用细胞凋亡作为一种保护机制。其二，有利于清除完成正常使命的衰老细胞。人红细胞分化成熟后是无核有功能细胞，可存活120d,然后自然死亡。其三，维持器官，组织，细胞数目相对平衡细胞凋亡是同细胞增殖相反的过程，两者既对立又统一，相互协调。细胞凋亡检测技术的展望目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。进行细胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致,进入细胞就又多了一层屏障。Allnexinv及其变体、Sytl一CZA和APosense家族的某些分子的临床应用取决于它们研究的进展。相信随着对细胞凋亡认识的不断深入和检测技术的发展,特异性更强、灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。