《仪器分析》高效液相色谱法

第十章高效液相色谱法学习目标1.掌握高效液相色谱仪的基本结构、功能和特点；2.了解高效液相色谱法的分类及应用。主要内容§10-1高效液相色谱仪§10-2高效液相色谱的类型高压输液系统分离系统数据处理系统进样系统检测系统§10-1高效液相色谱仪一、高压输液系统储液瓶脱气装置高压输液泵梯度洗脱装置高压输液系统（一）储液瓶用于存放流动相。储液瓶材料要耐腐蚀，常用的材料为玻璃、不锈钢、或表面喷涂聚四氟乙烯的不锈钢等；储液瓶应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内；流动相：色谱纯有机溶剂、新鲜去离子水（二）脱气装置流动相使用之前需要脱气脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。脱气方式有吹氦脱气、超声波脱气、真空脱气等。超声脱气（三）高压输液泵高压输液泵：提供流动相和样品通过色谱柱、进入检测器所需的动力，其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。高压输液泵应流量稳定，以保证测定结果的重复性和定量定性分析的精度；输出压力高，流量范围宽；耐酸、碱、缓冲液腐蚀；压力波动小；死体积小。流动相的注意事项：•防止固体微粒进入泵体——流动相和样品必须过滤有机系0.45μm滤膜，水系0.45μm滤膜•流动相不应含有腐蚀性物质，缓冲液不能保留在泵内——纯水清洗•防止溶剂瓶内的流动相被用完•不超过规定的最高压力（1）等度洗脱：流动相组成恒定（2）梯度洗脱：流动相组成改变（四）梯度洗脱装置梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;基线漂移、重现性差。适用于组分多，极性范围宽的复杂样品二、进样系统六通阀Load状态注入样品液Inject状态进样操作：load时，注入样品扳至Inject约1min后，扳回load，拔针三、分离系统色谱柱是高效液相色谱仪的重要部件，由柱管和固定相组成按主要用途可分为分析型色谱柱和制备型色谱柱；四、检测系统高效液相色谱仪中的检测器是通过将组分的量转变成为电信号；检测器应具备灵敏度高、响应对流动相流量及温度变化都不敏感、死体积小、线性范围宽、适用范围广、重现性好的特点。四、检测系统常用的检测器有紫外吸收检测器（UVD）蒸发光散射检测器（ELSD）示差折光检测器（RID）荧光检测器（FLD）电导检测器（ECD）质谱检测器（MSD）紫外吸收检测器（UVD）紫外检测器是使用最广泛的一种检测器特点：灵敏度较高，噪声低，检出限小，适合分析有紫外吸收的物质；为浓度型检测器；选择性检测器，仅对有紫外吸收的物质有响应；可用于制备，或与其它检测器串联使用；对温度和流动相流量波动不敏感，可用于梯度洗脱。§10-2高效液相色谱的类型一、液固吸附色谱二、液-液分配色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱五、凝胶色谱法（一）正相键合相色谱法（NBPC）（二）反相键合相色谱法（RBPC）一、液-固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂1、基本原理：利用各组分吸附能力的差异而分离的；吸附能力大的组分，分配系数大，保留值就大（后出峰）。2、固定相：极性固定相：硅胶、氧化铝、氧化镁、分子筛；非极性固定相：活性炭较常使用的是5～10μm的全多孔型硅胶吸附剂。以极性吸附剂为固定相时，组分的极性越大，保留值就越大。不同类型的有机物在极性吸附剂上的保留时间如下：氟碳化合物饱和烃烯烃芳烃有机卤化物醚硝基化合物腈酯、醛、酮醇羧酸硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷流动相影响分离的选择性3、流动相（也称洗脱液）：极性大的样品用极性大的流动相，极性小的样品用极性小的流动相；4、应用具有不同官能团的化合物油溶性试样同分异构体思考：（邻、间、对）硝基苯胺的三种异构体极性大小？邻位间位对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合分离的物质（二）液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；1、基本原理：利用组分在固定相和流动相上的溶解度不同而分离；分配系数大，保留值就大。2、固定相：将固定液涂于载体，易流失，较少采用；固定相极性-流动相非极性反相分配色谱正相分配色谱分离极性物质固定相非极性-流动相极性分离芳烃、烷烃等弱极性物质3、按固定相与流动相的极性大小可分为：化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机官能团键合在载体（硅胶表面的游离羟基）上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。优点：稳定，不易流失。三、化学键合相色谱1、定义2、键合相色谱的种类和选择正相键合相色谱：固定相极性流动相极性固定相：极性键合相（氰基、氨基、二醇基键合相）流动相：非极性或弱极性有机溶剂分离中等极性至强极性的化合物极性强的组分→K→tR→出峰大长后反相键合相色谱：固定相极性流动相极性固定相：非极性键合相，如十八烷基硅烷键合相（C18柱/ODS柱）、苯基、苯甲基键合相流动相：甲醇-水；乙腈-水分离非极性、弱极性至中等极性的化合物极性强的组分→K→tR→出峰小小先思考：以ODS柱、甲醇-水为流动相分离以下两种酸，试判断出峰次序？COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸3,4-二羟基苯甲酸已知组分极性:没食子酸3,4-二羟基苯甲酸没食子酸先出峰（保留值较小）总结1：HPLC与经典LC的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，占有机物总数的80%；流动相的选择：GC采用的流动相中为“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相除了起运载作用外，影响组分分离的关键因素操作温度：GC需高温；HPLC常室温进行总结2：HPLC与GC的比较课堂练习1、液液分配色谱法中的反相液相色谱法，其固定相、流动相和分离化合物的性质分别为（）A、极性、非极性和非极性C、极性、非极性和极性D、非极性、极性和离子化合物B、非极性、极性和非极性答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习2、分配色谱法和化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）D、提高色谱柱柱效能C、增加保留时间B、增大容量因子A、提高分配系数答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习3、在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）A、异构体D、沸点相差大的样品B、沸点相近，官能团相同的化合物C、极性范围宽的样品答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习4、高效液相色谱中属于通用型检测器的是（）A、紫外检测器C、荧光检测器D、电导检测器B、示差折光检测器答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习5、在液相色谱中，常用作固定相，又可用作键合相基体的物质是（）A、分子筛C、氧化铝D、活性炭B、硅胶答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习6、用十八烷基硅烷键合硅胶柱分离一有机弱酸混合物样品，以甲醇-水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的方法是（）A、增加流动相中甲醇比列C、流动相中加入少量的醋酸B、增加流动相中水的比例D、流动相中加入少量的氨水答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习7、在反相键合色谱法中固定相与流动相的极性关系是（）A、固定相的极性流动相的极性C、固定相的极性=流动相的极性D、不一定，视组分性质而定的B、固定相的极性流动相的极性答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习8、下列那种因素将使组分的保留时间变短？A、减慢流动相的流速D、正相色谱流动相为正己烷-二氯甲烷，增大正己烷比例B、增加色谱柱柱长C、反相色谱流动相为乙腈-水，增加乙腈比例答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习9、在反相键合相色谱中，流动相常用（）A、烷烃加醇类C、水D、缓冲盐溶液B、甲醇-水答错了，再来一次答对了，点击此处进入下一题课堂练习10、在液相色谱中，以缓冲液为流动相的是（）D、液-固吸附色谱C、化学键合相色谱B、凝胶色谱A、离子交换色谱答错了，再来一次答对了，OVER！